郭蕊

(河北省昌黎縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北昌黎066600)

副豬嗜血桿菌病細(xì)菌分離及PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

郭蕊

(河北省昌黎縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北昌黎066600)

本病又稱為革拉斯?。℅lsser Disease），是由副豬嗜血桿菌引起的豬的又一種新的細(xì)菌性傳染病，以多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行、共濟(jì)失調(diào)和被毛粗亂、胸膜炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。也可引起母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。該病目前呈世界性分布，在我國的發(fā)病也呈上升的趨勢(shì)，造成的經(jīng)濟(jì)損失日益嚴(yán)重，但豬副嗜血桿菌病與豬鏈球菌病、豬傳染性胸膜肺炎（嗜血桿菌）等可引起呼吸系統(tǒng)的疾病不易區(qū)分，且混感率較高，為該病的診斷帶來一定的困難。

副豬嗜血桿菌為革蘭氏染色陰性，有莢膜，具有多種不同的形態(tài)。該菌生長時(shí)嚴(yán)格需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD或V因子）。流行菌株在TSA平板的菌落呈針尖大小、灰白色、透明。本菌至少有15種血清型，另有大量分離株血清型不可定型，目前在我國的主要流行菌株是4、5、14和15型等，且不同地區(qū)不同分離菌株致病力差異較大。14～120日齡的豬均易感，但通常見于5～8周齡的豬發(fā)病。發(fā)病率 10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%～60%。

因此為了保證診斷的準(zhǔn)確性，在最短的時(shí)間內(nèi)對(duì)豬群進(jìn)行處理，繼而降低經(jīng)濟(jì)損失，我們采取細(xì)菌分離與PCR結(jié)合的方法來對(duì)其進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

某發(fā)病豬場的病豬及送檢病、死豬。

1.2 臨床癥狀

發(fā)熱、食欲不振、厭食、反應(yīng)遲鈍、呼吸困難、咳嗽、疼痛（尖叫）、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、顫抖、共濟(jì)失調(diào)、可視黏膜發(fā)紺、側(cè)臥，消瘦和被毛凌亂，隨之可能死亡。急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行。肉眼病變主要是全身性漿液性、化膿性、纖維素性炎癥，包括心、肺、肝等內(nèi)臟器官、腹膜、心包膜、胸膜、及其關(guān)節(jié)表面（圖3～6）等，尤其是腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)，出現(xiàn)漿液性和化膿性纖維蛋白滲出物。診斷本病時(shí)應(yīng)注意與鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、支原體多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎等相區(qū)別，本病確診有賴于細(xì)菌學(xué)以及分子生物學(xué)檢查。

2 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

2.1 主要試劑與儀器

牛血清、TSA、輔酶I(煙酞胺腺嘌呤二核苷酸NAD)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)箱、電子秤、搖床、高速冷凍離心機(jī)等。

TSA固體培養(yǎng)基:準(zhǔn)確稱取胰蛋白大豆瓊脂(TSA)40克，加入940毫升蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，高壓蒸汽滅菌15分鐘，加入50毫升過濾除菌的牛血清、10毫升過濾除菌的0.01%NAD，充分搖勻后倒平皿。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

無菌采集胸膜、胸腹腔積水、心包積液、關(guān)節(jié)液等病料，分別接種于自制的TSA固體培養(yǎng)基平板，置于5%～10%CO2中培養(yǎng)，37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48小時(shí)后，檢查其在培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)、菌落特征等培養(yǎng)特性，結(jié)果顯示菌株在TSA平板的菌落呈針尖大小、灰白色、透明（圖1），然后純培養(yǎng)與鑒定。

對(duì)培育菌株進(jìn)行革蘭氏染色以及培養(yǎng)后接種于脈酶、氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微型生化鑒定管等進(jìn)行生化指標(biāo)的測(cè)定，37℃培養(yǎng)，24～48小時(shí)后觀察現(xiàn)象。革蘭氏染色陰性，多種不同形態(tài)的小桿菌（圖2）。

將培育菌株劃線接種于鮮血瓊脂平皿，用紙片法將20種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37℃胚培養(yǎng)24～36小時(shí)，觀察結(jié)果顯示：本菌對(duì)紅霉素、氨基甙類、壯觀霉素和林可霉素有抗藥性。

3 PCR檢測(cè)

3.1 主要試劑與儀器

電泳緩沖液TAE、PBS、DNA marker、EB、各種型號(hào)移液器及滴頭、氯仿以及其他分析純等。

PCR儀、電泳儀、電子天平、超凈工作臺(tái)、水浴鍋、高速低溫離心機(jī)、高壓滅菌鍋等。

3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

將被檢菌液12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清液，用無菌水懸浮，渦旋后于沸水中水浴10分鐘后，再放置-20℃凍結(jié)，然后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液作為DNA模板。根據(jù)副豬嗜血桿菌序列設(shè)計(jì)引物，由上海生某公司合成。

采用50微升反應(yīng)體系：上下游引物1.5微升，2.5毫摩爾 dNTPs 4.0微升，Exbuffer 5.0微升，ExTaq酶0.5微升，模板DNA 8.0微升、滅菌雙蒸水30微升。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，共30循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增片段的大小。

1%瓊脂糖凝膠的配制:稱取3克瓊脂糖，加入300毫升lxTAE溶液，微波爐加熱至完全溶解。稍微冷卻，加入溴化乙錠(EB至終濃度為5微克/毫升)，趁熱倒入制膠槽，高度約0.5厘米，自然凝固后，小心拔出梳子，將平板放入電泳槽中，加樣孔一端朝向陰極。電泳槽內(nèi)倒入足夠的lxTAE溶液，使之正好沒過制好的瓊脂面。

加樣:PCR產(chǎn)物15微升與3微升6x加樣緩沖液混合均勻，用微量進(jìn)樣器吸取混合液，Tip頭伸入液面以下，對(duì)準(zhǔn)加樣孔，緩慢推出使樣品垂直落入加樣孔內(nèi)。電泳:蓋上電泳槽電泳40～50分鐘，然后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得約822堿基對(duì)的特異性片段，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)序列測(cè)定，其序列與目的基因序列一致。

M：DNA Marker；1：目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物

4 結(jié)論

4.1 近年來，該菌在我國豬群普遍存在（感染率呈明顯的上升趨勢(shì)），且臨床癥狀又與鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌等疾病極其相似不易區(qū)分，因此必須要通過細(xì)菌分離及PCR檢測(cè)的方法進(jìn)行確診，避免因誤診造成不必要的損失。

4.2 副豬嗜血桿菌抗藥性日漸增強(qiáng)也已成為不可忽視的問題，疾病發(fā)生的早期，治療或保健性預(yù)防用藥效果明顯，但一定要選擇敏感的抗菌素藥物。大多數(shù)副豬嗜血桿菌對(duì)頭孢類抗生素、氟苯尼考、替米考星及喹諾酮類高度敏感，但對(duì)一些氨基甙類、壯觀霉素和林可霉素有抵抗力，所以說，對(duì)豬場副豬嗜血桿菌進(jìn)行定期的敏感性藥物監(jiān)測(cè)，有利于減少經(jīng)濟(jì)損失，保證豬群健康。

4.3 副豬嗜血桿菌疫苗是預(yù)防該病的最為有效的方法之一，但不同血清型菌株之間的交叉保護(hù)率相對(duì)較低，因此，疫苗的使用具有一定的區(qū)域性和局限性，一定要有血清型的針對(duì)性才能取得良好的防疫效果。從當(dāng)?shù)胤蛛x的菌株制備滅活苗，可有效控制副豬嗜血桿菌病的發(fā)生。同時(shí)做好豬瘟、偽狂犬病、藍(lán)耳病、口蹄疫等預(yù)防免疫工作，有利于減少本病的發(fā)生。

4.4 同時(shí)加強(qiáng)對(duì)豬群飼養(yǎng)管理。保證勤打掃，常通風(fēng)，實(shí)行嚴(yán)格的定期消毒制度，特別是冬季一定要做好保溫與通風(fēng)的協(xié)調(diào)，盡量減少應(yīng)激。減少或消除其他呼吸道病原，如提前斷奶，減少豬群流動(dòng)，杜絕豬生產(chǎn)各階段的混養(yǎng)狀況等，并在疫病多發(fā)季節(jié)，在飼料中添加增強(qiáng)體質(zhì)的藥物如：黃芪多糖、電解多維、VC、VE以增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，減少應(yīng)激，都可有效增強(qiáng)豬體自身免疫力減少本病的發(fā)生。

圖1 副豬嗜血桿菌菌落形態(tài)

圖2 副豬嗜血桿菌形態(tài)

圖3 心包積液，心臟周圍出現(xiàn)纖維素性炎癥

圖4 肺臟包膜

圖5 肺臟黏連

圖6 腹腔出現(xiàn)化濃性炎癥