許遠，魏和平，吳彥

(安慶師范學院生命科學學院，安徽 安慶246011)

響應(yīng)面優(yōu)化長裙竹蓀總黃酮提取工藝研究

許遠，魏和平，吳彥

(安慶師范學院生命科學學院，安徽 安慶246011)

[摘要]通過單因素試驗探討了乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度對長裙竹蓀(Dictyophoraindusiata)總黃酮得率的影響，并進一步通過響應(yīng)面分析對超聲波輔助乙醇提取長裙竹蓀總黃酮的最佳工藝條件進行了優(yōu)化，得出最佳工藝條件為：乙醇濃度75.5%，液料比16.5∶1，超聲時間19min，超聲溫度56℃。在此工藝條件下，長裙竹蓀總黃酮得率達到3.03mg/g。

[關(guān)鍵詞]長裙竹蓀(Dictyophoraindusiata)；總黃酮；響應(yīng)面

黃酮類化合物是一類天然抗氧化化合物[1]，具有清除自由基、抗菌、防癌、防止毛細管滲透、鎮(zhèn)痛等多種生物活性功能[2，3]?，F(xiàn)代社會“高脂肪、高蛋白、高能量”的飲食結(jié)構(gòu)帶來癌癥、心血管等多種疾病高發(fā)，食物來源的黃酮天然、低毒、高效，對于此類疾病的防治功效顯著[4]。營養(yǎng)學研究顯示，眾多品種食用菌不僅富含多糖、多酚等生物活性物質(zhì)，也具有高含量的黃酮類化合物[5～8]。竹蓀(Dictyophpraspp.)是一類名貴大型食用真菌，營養(yǎng)豐富，口味鮮美獨特，素有 “真菌皇后”、“山珍之王”等美稱，歷代列為貢品，在現(xiàn)代亦成為食療佳品[9]。目前，針對竹蓀黃酮類化合物提取工藝的研究尚未見報道。因此，本研究通過超聲波輔助乙醇提取法對長裙竹蓀子實體叫黃酮含量進行了測定，并采取響應(yīng)面分析方法對其提取工藝進行了優(yōu)化，旨在為進一步開發(fā)利用竹蓀黃酮類化合物提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

長裙竹蓀子實體干粉為市售，以粉碎機粉碎，過60目篩，制成干粉，儲存于冰箱(0～4℃)備用。

試劑：蘆丁標準品(>98%)，合肥博美生物科技有限責任公司；無水乙醇、鹽酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉等均為分析純。

儀器：FA2004B電子天平(上海越平科學儀器有限公司) ；手提式多功能粉碎機(上海廣沙工貿(mào)有限公司)；DZ-2BCⅡ真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海洪旋實驗儀器有限公司)；SY-360型臺式數(shù)控超聲波提取機(昆山市超聲儀器有限公司)；UV759紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)；HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2試驗方法

1.2.1標準曲線繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[10]，得標準曲線回歸方程：D= 3.5033C+ 0.3718(D為光密度，C為蘆丁濃度)，R2= 0.9968，表明了蘆丁在濃度0～0.3mg/mL之內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2長裙竹蓀總黃酮提取工藝流程

長裙竹蓀→晾干→粉碎→過篩→稱量→混合乙醇溶液→超聲處理→回流提取→濃縮→長裙竹蓀濾液

取2mL上述濾液于10mL容量瓶中，以制備標準曲線的方法，在 510nm 處測定其光密度，并根據(jù)標曲回歸方程計算長裙竹蓀總黃酮得率，重復(fù)3次，取平均值，計算公式如下：

式中：C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V1為顯色時定容體積，mL；V2為顯色時取樣體積，mL；V為提取液總體積，mL；m為原料質(zhì)量，g。

1.2.3單因素試驗

以乙醇濃度、液料比、超聲溫度、超聲時間4個因素為研究對象，以長裙竹蓀總黃酮得率為指標，進行單因素試驗。每因素試驗時，待測因素按表1依次取值，其他因素固定取值如下：乙醇濃度70%、液料比12∶1、超聲溫度50℃、超聲時間15min。

表1　單因素取值水平

1.2.4響應(yīng)面法對提取工藝參數(shù)的優(yōu)化與驗證

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)之上，根據(jù) Box-Benhnken 中心組合實驗設(shè)計原理，運用 Design Expert 8.0 軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗，分別選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)作為自變量，以長裙竹蓀總黃酮的得率(R1) 作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗，以此分析各因素間交互作用對長裙竹蓀總黃酮得率的影響，因素水平取值見表2。

表2　響應(yīng)面設(shè)計因素和水平

1.3數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2003軟件整理數(shù)據(jù)，Design Expert 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1乙醇濃度的選擇

圖1顯示,總黃酮得率隨乙醇濃度升高而上升，達到 75%后略呈下降趨勢。原因可能是黃酮類物質(zhì)屬弱極性化合物，當溶劑與提取物極性趨近時，提取物更易從細胞中溢出[11]，乙醇是提取黃酮的優(yōu)良有機溶劑之一[12]，75%的乙醇溶液極性可能與長裙竹蓀黃酮的極性最為相似，故在此濃度下提取率最高。而當濃度高于75%后，溶劑極性與提取物極性差異逐漸增大，導(dǎo)致溶解度降低，進而影響得率[13]。故乙醇濃度選用70%～80%進行響應(yīng)面實驗分析。

2.1.2液料比的選擇

圖2 顯示：總黃酮得率隨液料比的增加不斷增大，大于16∶1后曲線略有下降并逐漸平穩(wěn)。原因可能是隨液料比的增大，使得濃度差提高，有利于傳質(zhì)，提取越來越充分，而當黃酮的溶出已基本達到平衡時，即便再增加溶劑量，也不能再增加得率，且由于溶劑量的增大，還可能使得一些非黃酮類的化合物溶解度增大，與黃酮類化合物形成了一定的競爭關(guān)系，從而導(dǎo)致提取含量減少。故液料比選用14∶1 ～18∶1進行響應(yīng)面實驗分析。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響圖2 液料比對總黃酮得率的影響

2.1.3超聲時間的選擇

圖3顯示：總黃酮得率隨超聲波作用時間的增加而升高，大于20min 后總黃酮得率呈平緩下降趨勢。原因是超聲波的空化作用可充分破壞植物細胞，加速胞內(nèi)物質(zhì)釋放溶解，增大提取效率[14，15]，但過長的超聲時間可能會破壞黃酮類化合物的有效結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致降解。故超聲時間選用15～25min進行響應(yīng)面實驗分析。

2.1.4超聲溫度的選擇

圖4顯示：總黃酮得率隨超聲溫度的升高呈上升趨勢，達到55℃后趨于下降。原因是較高的溫度可能破壞樣品中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而造成損失，同時高溫導(dǎo)致提取液的揮發(fā)量增加，從而導(dǎo)致得率下降。故超聲溫度選用50～60℃ 為宜。

2.2響應(yīng)面法確定長裙竹蓀總黃酮的最佳提取條件

2.2.1響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果

選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)、及超聲溫度(D) 作為自變量，以長裙竹蓀總黃酮的得率(R1) 作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表3。

表3　響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design Expert 8.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，擬合后得到A、B、C、D的二次多項回歸模型為：

長裙竹蓀總黃酮得率(mg/g)= 0.80183A+1.45092B+0.90243C+1.16123D-7.00000×10-3AB-3.20000×10-3AC+3.10000×10-3AD+1.25000×10-3BC+1.25000×10-3BD-5.50000×10-3CD-5.25667×10-3A2-0.029417B2-8.20667×10-3C2-0.011657D2-80.84067

對上述方程進行方差分析，結(jié)果如表4所示。

結(jié)果顯示，模型顯著性檢驗P值< 0.0001，為極顯著，失擬項P值為0.0664>0.05，不顯著，無失擬因素存在。該回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9990，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9980，說明該模型能夠解釋99.90%的變化，因變量與所選自變量之間線性關(guān)系顯著。以上證明該模型與試驗擬合度良好，可用該模型代替真實實驗對實驗結(jié)果進行預(yù)測和分析。

模型的一次項A、B、C、D為極顯著;二次項A2、B2、C2、D2為極顯著；交互項AB、AC、AD、CD為極顯著，BC、BD為顯著，由此可知，自變量與響應(yīng)值之間非簡單線性關(guān)系。通過F值可知，各單因素對長裙竹蓀總黃酮得率的影響程度依次為：超聲溫度>超聲時間>液料比>乙醇濃度；各兩因素交互作用對長裙竹蓀總黃酮得率的影響程度依次為：超聲時間和超聲溫度>乙醇濃度和超聲時間>乙醇濃度和超聲溫度>液料比和乙醇濃度>液料比和超聲時間=液料比和超聲溫度。

表4　回歸模型方差分析

注：* 表示P<0.05,**表示P<0.001。

2.2.2響應(yīng)面分析

圖5是按所得數(shù)學模型繪制的響應(yīng)曲面圖，響應(yīng)曲面的坡度變化及其等高線反映了各因素間交互作用效應(yīng)。其坡度直接反映了在處理條件下發(fā)生變化時長裙竹蓀總黃酮得率的響應(yīng)靈敏程度，如坡度相對平緩，響應(yīng)值不敏感；反之，如坡度相對陡峭，響應(yīng)值敏感。響應(yīng)值隨哪種因素的變化率更大，說明該因素在二者交互作用中對長裙竹蓀總黃酮得率的影響更大。等高線為橢圓形，說明兩因素交互作用顯著，若偏圓形，說明不太顯著。

從圖5f可知，其等高線為橢圓形，說明超聲時間和超聲溫度交互作用顯著；響應(yīng)面坡度較為陡峭，響應(yīng)值隨超聲溫度的變化率大于超聲時間的變化率，說明在二者交互作用中超聲溫度對總黃酮得率影響大于超聲時間。而從圖5d可知，其等高線較其他偏圓形，說明液料比和超聲時間交互作用不太顯著；響應(yīng)面坡度相對平緩，響應(yīng)值隨超聲時間的變化率大于液料比的變化率，說明在二者交互作用中超聲時間對總黃酮得率影響大于液料比。綜合所有響應(yīng)面圖分析，超聲時間和超聲溫度的交互作用最顯著，乙醇濃度和超聲時間、乙醇濃度和超聲溫度、乙醇濃度和液料比次之，液料比和超聲時間、液料比和超聲溫度最不顯著，其中超聲溫度和超聲時間較之乙醇濃度和液料比對響應(yīng)值的影響更大，此結(jié)果與模型中F值分析結(jié)果一致。

2.2.3條件優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面分析表明： 最佳提取工藝理論值是乙醇濃度75.48%，液料比16.29∶1，超聲時間19.17min，超聲溫度56℃?？紤]到實際操作的便利，將長裙竹蓀中總黃酮提取的最佳工藝條件修正為：乙醇濃度75.5%，液料比16.5∶1，超聲時間19min，超聲溫度56℃。按照修正后的條件下進行3次驗證試驗，結(jié)果如表5 所示，長裙竹蓀總黃酮得率實驗值為3.03mg/g，與預(yù)測值3.03mg/g一致，表明試驗結(jié)果理想，試驗?zāi)Ｐ瓦x擇合理。

圖5　各因素對總黃酮得率影響的響應(yīng)面分析

項目序號123平均值總黃酮得率/(mg·g-1)3.023.043.033.03

3結(jié)論

目前，提取黃酮類化合物的方法主要

有水浸提法、酶解法、超臨界萃取法、微波輔助提取法與超聲波輔助提取法等[16～20]，超聲波輔助提取法因操作簡單、方便、能耗低、無副產(chǎn)物等優(yōu)點而備受青睞[21]，許多研究者依據(jù)此法獲得了準確的數(shù)據(jù)，如羅彩林等[22]利用超聲波輔助提取法進行大米草總黃酮提取工藝研究，趙強等[23]利用該法進行了苦蕎皮總黃酮提取的工藝優(yōu)化,王辰等[24]也利用該法進行了葛根黃酮的提取。

因此，本研究采用超聲波輔助乙醇提取法提取長裙竹蓀總黃酮，根據(jù)中心組合設(shè)計原理，采用4 因素3 水平的響應(yīng)面分析，得出了長裙竹蓀總黃酮的最佳提取工藝條件：乙醇濃度75.5%，液料比16.5∶1，超聲時間19min，超聲溫度56℃，在此條件下測得長裙竹蓀總黃酮含量為3.03mg/g，可為進一步研究竹蓀黃酮類化合物提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-1409(2015)15-0067-07

[中圖分類號]TS201.1