李博科 王東文

·綜述·

膀胱癌特異性核基質蛋白-4在膀胱癌研究中的進展

李博科 王東文

膀胱癌是我國泌尿外科臨床上最常見的惡性腫瘤。根據腫瘤對膀胱壁的浸潤深度，可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌。近70%的患者為非肌層浸潤性腫瘤，膀胱癌整體5年生存率可達77%，僅5.5%的患者出現遠處轉移[1]。但由于膀胱癌具有較高的復發(fā)率，腫瘤惡性程度可伴隨復發(fā)、逐漸進展等特點，使膀胱癌遠期預后不佳[1]。低、中風險的膀胱癌患者在行經尿道膀胱腫瘤電切術后1年分別有20%、40%的復發(fā)率，高風險患者復發(fā)率可達90%[2]。膀胱癌的早期診斷和預后監(jiān)測是治療的核心。長期以來，膀胱鏡活檢一直作為早期診斷、術后隨診和預后監(jiān)測的金標準。為了提高無創(chuàng)檢測膀胱癌的水平，尿膀胱癌標志物的研究受到了很大的關注，美國食品藥品管理局(FDA)已批準膀胱腫瘤相關抗原測定(BTAstat；BTAtrak)、核基質蛋白(NMP)22、纖維蛋白降解產物(FDP)、免疫細胞化學檢測(ImmunoCyt)和熒光原位雜交(FISH)用于膀胱癌的檢測。多項研究顯示FISH技術具有較高的敏感性和特異性[3-6]，目前已有多種商品化的FISH試劑盒用于臨床。但對于有膀胱炎癥、結石、放療等病史者的尿液標本，反應性脫落細胞可能造成FISH結果的特異性降低[7]。Hajdinjak[8]選用FISH技術檢測尿液中脫落細胞染色體3、7、17和9p21的突變情況，Meta分析結果顯示，FISH診斷膀胱癌總體敏感度為72%，特異度為83%，ROC曲線下面積為0.867。一項前瞻性研究結果顯示，FISH檢測可用于非肌層浸潤性膀胱癌的復發(fā)預測，其中9p21缺失可作為膀胱癌復發(fā)的獨立預測因子，預測復發(fā)的敏感度為45.6%，特異度為85.3%[9]。然而，FISH陽性的評判標準目前尚未統一，對檢查員的技術要求高，檢查耗時較長，且并非所有膀胱癌細胞的染色體都會呈現3、7、17或9p21的突變[10]。膀胱癌特異性核基質蛋白-4(bladder cancer specific nuclear matrix protein-4, BLCA-4)是一種無創(chuàng)性、高敏感度、高特異度的膀胱腫瘤檢測指標，具有廣闊的應用前景，現對其在膀胱癌研究中的進展作一總結。

一、BLCA-4的發(fā)現和生物學特性

核基質是細胞核的框架，是細胞核內除去核仁、核膜、核纖質和染色質以外的纖維蛋白網架體系。其主要成分為蛋白質和RNA，功能除了維持細胞核形態(tài)以外，還參與基因轉錄加工、染色體的分配等重要的核內反應[11]。

NMP：1974年Berezney和Coffey[12]首先報道了NMP，NMP是細胞核的網狀骨架，約占全部核蛋白的10%，主要成分是纖維蛋白，不含脂質、DNA和組蛋白。NMP在維持細胞核的形態(tài)結構、染色體組裝、DNA復制和RNA轉錄等一系列活動中發(fā)揮重要作用。許多惡性腫瘤機體均發(fā)生NMP成分及結構的變化，因此其可作為檢測惡變的指標。NMP在不同的細胞及組織中，包括正常及腫瘤組織中顯示出一定的特征性及差異性[13]，這為篩選癌癥相關的特異性分子標志物提供了可能。其中NMP22是美國FDA第一個批準用于膀胱癌監(jiān)測的NMP，已經在美國商品化應用數年時間。但其檢測結果受血尿、尿路感染、尿液濃縮等因素影響較大[14]。隨著對NMP越來越多的研究，發(fā)現BLCA-4是具有潛在臨床應用前景的膀胱腫瘤標志物。

Getzenberg等[15]于1996年首次通過雙向凝膠電泳法，對17例膀胱癌患者的癌組織和正常人膀胱組織進行對比研究分離出9種膀胱NMP，其中有6種僅在膀胱癌組織中表達，而在正常人膀胱組織中不表達，這6種膀胱癌NMP分別命名為BLCA-1、2、3、4、5、6。另外3種僅存在于正常的膀胱組織而癌組織中不表達，分別命名為BLNL-1、2、3。對膀胱癌細胞系253j、UMUC-2 和T24的研究發(fā)現，BLCA-1、2、3、4、6存在于3種癌細胞系中，僅BLCA-5不存在這些癌細胞系中。同樣BLNL-1、2、3也不存在上述膀胱癌細胞系中。NMP在細胞死亡后被釋放出來，以可溶性的復合物或片段(相對分子量為30 000左右)的形式存在于人的尿液中[16]，BLCA-4在正常膀胱組織中不表達而存在于膀胱癌組織中，所以尿中檢測出BLCA-4可以提示膀胱癌的存在。

二、BLCA-4在膀胱癌篩選和診斷中的研究

2000年Konety等[17]利用免疫印跡法檢測了12例病理結果確診為膀胱癌患者的癌組織、相鄰“正?！苯M織及11例病理結果排除膀胱病變的正常人膀胱組織中BLCA-4的水平，結果發(fā)現BLCA-4在膀胱癌患者癌組織及相鄰“正常”組織均有表達。12例膀胱癌患者的“正常”組織BLCA-4水平全部陽性，癌組織中有9例陽性(剩余3例在過度曝光后呈現低表達)，11例正常人膀胱組織BLCA-4水平均未表達(在印跡分析中過度曝光也未表達)。并且發(fā)現BLCA-4表達與腫瘤分期相關，然而再用ELISA檢測尿BLCA-4表達則與腫瘤分期沒有相關性。同時，他們用免疫測定法，分析了55例膀胱癌患者尿液樣本和51例正常人尿液樣本，結果發(fā)現55例膀胱癌患者中有53例尿液中BLCA-4陽性，靈敏度96.4%(95%置信區(qū)間：87.5%～99.6%)，51例正常人尿液中BLCA-4均為陰性，特異度100%(95%置信區(qū)間：93%～100%)。認為BLCA-4存在于膀胱癌患者的癌組織和“正?！苯M織，并且BLCA-4是一項高敏感度、高特異度的膀胱癌尿液標志物，可運用于膀胱癌的篩選和早期診斷。

同年，Konety等[18]對51例正常對照受試者、55例膀胱癌患者和202例脊髓損傷患者的尿液通過免疫測定法檢測BLCA-4水平，評估了在脊髓損傷患者中BLCA-4水平與泌尿系感染、吸煙、留置尿管、膀胱炎的關系。結果表明51例正常對照者的尿液BLCA-4水平均低于臨界值(臨界值設為每微克蛋白13 OD)，55例膀胱癌患者中有53例尿液BLCA-4水平高于臨界值，202例脊髓損傷患者中有38例尿液BLCA-4水平高于臨界值。Konety等認為尿液中BLCA-4水平的過表達有助于對普通人群和高危群體中進行膀胱腫瘤的篩選和診斷，且尿液中BLCA-4水平與泌尿系感染、吸煙、留置尿管、膀胱炎均無相關性。

2010年，國內孫忠全等[19]根據當時已確定的BLCA-4的特異氨基酸片段序列：羥基端-EISQLNAGAC-氨基酸[17]，進行多肽合成，將多肽用Imject Immunogen EDC Conjugation Kit耦聯KLH作為抗原，用雜交瘤細胞制備了BLCA-4單克隆抗體，利用得到的純化抗BLCA-4單克隆抗體檢測15例膀胱癌標本，癌組織、癌旁組織、正常尿路上皮組織BLCA-4陽性表達分別為14、13和0例，敏感度和特異度分別為93.3%和100%。由于檢測BLCA-4的抗體多為多克隆抗體，而單克隆抗體的制備將使BLCA-4的檢測結果更準確，特異性更高，為進一步研究提供了實驗基礎。

2011年，Feng等[20]為了探討B(tài)LCA-4在檢測我國漢族膀胱癌患者尿液的可行性，對我國漢族79例膀胱癌患者、31例尿路感染患者和29例正常對照者的尿液通過ELISA法逐一分析，結果顯示尿液BLCA-4水平在膀胱癌組顯著高表達且高于其他兩組，其表達水平與年齡、性別、生長模式無關，敏感度為97.37%，特異度為100%，并且發(fā)現BLCA-4水平在肌層浸潤性膀胱癌患者中要高于非肌層浸潤性膀胱癌患者。同時利用免疫組化法檢測53例膀胱癌組織、24例病理正常的癌旁組織和15例正常對照膀胱組織標本的BLCA-4水平，腫瘤組織中BLCA-4有較高得分的染色，癌旁組織有41.67%發(fā)現BLCA-4陽性，中國漢族正常膀胱組織中BLCA-4水平均為陰性。Feng等認為BLCA-4存在于患者的組織和尿液中，通過檢測尿液BLCA-4水平診斷膀胱腫瘤是一種高靈敏度、高特異度的檢測方法，故BLCA-4在中國漢族膀胱癌人群中也有潛在的應用價值。

2014年，Xia等[21]通過檢索PubMed、EmBase(涵蓋1974年至今)和CBM(涵蓋1966年至今)數據庫，進行了一項Meta分析，共有7篇文獻納入，納入研究對象877例，其中病例組312例，對照組565例，所有納入研究均使用ELISA法進行BLCA-4的測定，結果顯示BLCA-4檢測的敏感度為0.85(95%置信區(qū)間：0.81～0.88)，特異度為0.97(95%置信區(qū)間：0.95～0.98)，擬合BLCA-4的SROC曲線下面積為0.980 6，表明尿BLCA-4水平的檢測可以作為一種快速、簡便、無創(chuàng)的膀胱癌篩查方法。

為了探討B(tài)LCA-4在浸潤性膀胱癌血液中的表達情況，王曉鵬[22]采用 ELISA 法檢測 BLCA-4在實驗組(72 例浸潤性膀胱癌患者的血液、尿液和膀胱組織)、對照組(包括 78 例前列腺增生患者的血液、尿液和膀胱組織，44 例體檢正常者和 34例泌尿系結石患者的血液和尿液)中的水平及表達情況。結果顯示實驗組浸潤性膀胱癌患者尿液中BLCA-4含量中位數為1.593，增生組含量為0.319，結石組含量為0.238，正常組為0.194 ，浸潤性膀胱癌患者尿液中BLCA-4 蛋白含量顯著高于其他3組(P<0.05)；而實驗組浸潤性膀胱癌患者血清中BLCA-4含量中位數為5.808，增生組、結石組、正常組血清中BLCA-4的含量分別為5.718、5.076、4.995，差異無統計學意義(P>0.05)。

榜樣的力量是無窮的，宋市長也明白這一點。第一次工作會他就讓秘書通知到市政府所在地的鎮(zhèn)里去開，而且強調會議要有效率，要開短會。保證會議上午十點半就能結束，各位鄉(xiāng)鎮(zhèn)長下午就能回到本單位開會落實會議精神。

三、BLCA-4在膀胱癌預后中的研究

2012年，Zhao等[23]研究評估了BLCA-4的組織表達與膀胱癌患者預后的關系，通過免疫組化法檢測了325例膀胱癌患者組織標本BLCA-4水平，結果顯示254例(78.2%)表達陽性，178例(54.8%)表達強陽性，發(fā)現BLCA-4的過表達與腫瘤的分級、分期密切相關，但未發(fā)現與患者的性別、年齡、腫瘤大小及數目相關。使用Kaplan-Meier法和Cox比例風險模型評估生存分析，多變量分析顯示BLCA-4是預測膀胱腫瘤患者總體生存率的獨立影響因子，其高表達導致了膀胱癌患者較差的預后。Zhao等認為BLCA-4可能成為膀胱癌預后的重要標志物。

為了進一步研究BLCA-4在膀胱癌患者術后監(jiān)測腫瘤復發(fā)中的意義，蔣民軍等[24]采用ELISA法，對20例無泌尿系統疾病史的健康志愿者、30例泌尿系統良性病變(如膀胱炎、前列腺增生、膀胱結石等)患者及30例病理診斷為尿路上皮癌的初發(fā)膀胱癌患者術前和術后1、6個月和1年尿液中BLCA-4的表達進行分析。結果顯示，以450 nm波長測量吸光度值，BLCA-4值>13.00 A/μg protein為臨界參考值，健康對照組尿液中BLCA-4表達值的中位數為0.97 A/μg protein，良性病變組尿液中BLCA-4表達值的中位數為2.19 A/μg protein，膀胱癌患者尿液中BLCA-4表達值的中位數為39.48 A/μg protein，膀胱癌組與健康對照組、良性病變組比較差異均有統計學意義，而健康對照組和良性病變組之間差異無統計學意義。此外，膀胱癌組有2例術前均診斷為膀胱癌T1期，行經尿道膀胱腫瘤等離子切除術，病理診斷分別為低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀腫瘤和低分級尿路上皮癌，術后1個月和6個月時尿液中BLCA-4表達均降至17 A/μg protein以下，而術后1年時尿液中BLCA-4表達值分別為98.52 A/μg protein和128.79 A/μg protein，較同期患者明顯升高，當時影像學及膀胱鏡檢查均未見異常，術后15個月時經膀胱鏡和影像學檢查證實腫瘤復發(fā)。故認為BLCA-4可作為監(jiān)測膀胱癌術后復發(fā)的標志物之一，先于膀胱鏡和影像學檢查預測復發(fā)，但需要加大樣本量及加強隨訪密度時間以獲得更有信服力的統計學結果。

2013年Ji等[25]通過PCR和焦磷酸測序法對血液中白細胞DNA的總體低甲基化測定，檢測是否與膀胱癌的風險有關。312例膀胱癌患者和361名健康對照者入選實驗。結果顯示膀胱癌組的中位甲基化水平(75.7% 5mC)明顯低于對照組(79.7% 5mC)。初步探討了在人血液中白細胞DNA的BLCA-4重復區(qū)域的總體低甲基化水平，會增加膀胱癌的風險，并提出了BLCA-4低甲基化對于膀胱癌預后不良的患者可能是有價值的生物學標志物。

四、BLCA-4作用機制及靶向治療的研究

為了研究BLCA-4的可能作用機制，Feng等[26]對53例膀胱癌患者組織標本進行了BLCA-4水平的免疫組化染色，探討了其與基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素-1α(IL-1α)、IL-8、色素上皮衍生因子(PEDF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及血管性假血友病因子在膀胱癌表達的相關性。結果發(fā)現BLCA-4的表達與IL-1α、IL-8、VEGF、MMP-9存在正相關，與PEDF、TNF-α、MVD不存在相關性。結果表明，BLCA-4未必在膀胱癌的促血管生成機制中起作用，但會與IL-1α、IL-8、VEGF、MMP-9相互作用，提高腫瘤的發(fā)生和侵襲。

五、結論和展望

膀胱鏡活檢仍是膀胱癌診斷和預后監(jiān)測的“金標準”，但對于早期或肉眼不可見的病變易遺漏，導致疾病的進一步發(fā)展，威脅患者健康及生活質量。BLCA-4可作為腫瘤標志物，以其高敏感性、高特異性、無創(chuàng)性用于普通人群和高危群體的篩選、早期診斷和預后監(jiān)測，彌補膀胱鏡檢查中漏診及有創(chuàng)的不足。

經總結后發(fā)現BLCA-4的研究有以下幾方面值得關注：①BLCA-4在正常人膀胱組織中未見表達，在膀胱癌組織和癌旁組織可見表達，因此可作為膀胱癌分子診斷的良好靶標。②BLCAs的其余成員在膀胱癌研究中的角色還不明確，有待進一步研究。③尿液中BLCA-4檢測的可重復性和標準化建立還不完善。④膀胱癌患者術后灌注前后BLCA-4的表達變化未見報道。⑤研制基于BLCA-4的光敏劑，對于早期發(fā)現病變部位，提高術中膀胱腫瘤電切的質量，盡可能完全清除腫瘤的原發(fā)病灶具有一定臨床研究前景。

[1] 葉章群,李凡. 膀胱癌的基礎與臨床研究進展[J]. 中華實驗外科雜志,2014,31(6):1162-1164.

[2] Shelley MD, Mason MD, Kynaston H. Intravesical therapy for superficial bladder cancer: a systematic review of randomised trials and meta-analyses[J]. Cancer Treat Rev,2010,36(3):195-205.

[3] Lokeshwar VB, Habuchi T, Grossman HB, et al. Bladder tumor markers beyond cytology: international consensus panel on bladder tumor markers[J]. Urology,2005,66(6 Suppl 1):35-63.

[4] Sarosdy MF, Schellhammer P, Bokinsky G, et al. Clinical evaluation of a multi-target fluorescent in situ hybridization assay for detection of bladder cancer[J]. J Urol,2002,168(5):1950-1954.

[5] Friedrich MG, Toma MI, Hellstem A, et al. Comparison of multitarget nuorescence in situ hybridization in urine with other noninvasive tests for detecting bladder cancer[J]. BJU Int,2003,92(9):911-914.

[6] Halling KC, King W, Sokolova IA, et al. A comparison of BTA stat, hemoglobin dipstick, telomerase and Vysis UroVysion assays for the detection of urothelial carcinoma in urine[J]. J Urol,2002,167(5):2001-2006.

[7] Tapia C, Glatz K, Obermann EC, et al. Evaluation of chromosomal aberrations in patients with benign conditions and reactive changes in urinary cytology[J]. Cancer Cytopathol,2011,119(6):404-410.

[8] Hajdinjak T. UroVysion FISH test for detecting urothelial cancers: meta-analysis of diagnostic accuracy and comparison with urinary cytology testing[J]. Urol Oncol,2008,26(6):646-651.

[9] Matsuyama H, Ikemoto K, Eguchi S, et al. Copy number aberrations using multicolour fluorescence in situ hybridization (FISH) for prognostication in non-muscle-invasive bladder cancer (NIMBC)[J]. BJU Int,2014,113(4):662-667.

[10] 馬重,林建水,曾蜀雄,等. 膀胱癌無創(chuàng)性早期診斷標志物的研究進展[J]. 上海醫(yī)學,2015,38(4):347-350.

[11] Berezney R. The nuclear matrix: a heuristic model for investigating genomic organization and function in the cell nucleus[J]. J Cell Biochem,1991,47(2):109-123.

[12] Berezney R, Coffey DS. Identification of a nuclear protein matrix[J]. Biochem Biophys Res Commun,1974,60(4):1410-1417.

[13] Replogle-Schwab R, Pienta KJ, Getzenberg RH. The utilization of nuclear matrix proteins for cancer diagnosis[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr,1996,6(2-3):103-113.

[14] Huber S, Schwentner C, Taeger D, et al. Nuclear matrix protein-22: a prospective evaluation in a population at risk for bladder cancer. Results from the UroScreen study[J]. BJU Int,2012,110(5):699-708.

[15] Getzenberg RH, Konety BR, Oeler TA, et al. Bladder cancer-associated nuclear matrix proteins[J]. Cancer Res,1996,56(7):1690-1694.

[16] Keesee SK, Briggman JV, Thill G, et al. Utilization of nuclear matrix proteins for cancer diagnosis[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr,1996,6(2-3):189-214．

[17] Konety BR, Nguyen TS, Dhir R, et al. Detection of bladder cancer using a novel nuclear matrix protein, BLCA-4[J]. Clin Cancer Res,2000,6(7):2618-2625.

[18] Konety BR, Nguyen TS, Brenes G, et al. Clinical usefulness of novel marker BLCA-4 for the detection of bladder cancer[J]. J Urol,2000,163(3 Pt 1):634-639.

[19] 孫忠全,汪東亞,黨希龍,等. 膀胱癌特異性核基蛋百BLCA-4單克隆抗體的制備及特異性檢驗[J]. 老年醫(yī)學與保健,2010,16(4):216-219.

[20] Feng CC, Wang PH, Guan M, et al. Urinary BLCA-4 is highly specific for detection of bladder cancer in Chinese Han population and is related to tumour invasiveness[J]. Folia Biol (Praha),2011,57(6):242-247.

[21] Xia Y, Guo XG, Ji TX. Diagnostic utility of urinary BLCA-4 tests for bladder cancer: a meta-analysis[J]. Life Sci J,2014,11(5):69-75.

[22] 王曉鵬. BLCA-4在浸潤性膀胱癌患者體液和組織中表達的研究[D]. 承德:承德醫(yī)學院,2014.

[23] Zhao Q, Shen WH, Chen ZW, et al. High expression level of BLCA-4 correlates with poor prognosis in human bladder cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol,2012,5(5):422-427.

[24] 蔣民軍,吳光,侯建全. 膀胱癌特異性核基質蛋白-4在膀胱癌患者尿液中的表達及其臨床意義[J]. 中華實驗外科志,2013,30(8):1754-1755.

[25] Ji HX, Zhao Q, Pan JH, et al. Association of BLCA-4 hypomethylation in blood leukocyte DNA and the risk of bladder cancer in a Chinese population[J]. Pathol Oncol Res,2013,19(2):205-210.

[26] Feng C, Wu Z, Guo T, et al. BLCA-4 expression is related to MMP-9, VEGF, IL-1α and IL-8 in bladder cancer but not to PEDF, TNF-α or angiogenesis[J]. Pathol Biol (Paris),2012,60(3):e36-40.

[27] Guo B, Che T, Shi B, et al. Interaction network analysis of differentially expressed genes and screening of cancer marker in the urine of patients with invasive bladder cancer[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(3):3619-3628.

(本文編輯：熊鈺芬)

·THP專欄·

吡柔比星膀胱灌注評估腫瘤組織藥物濃度和暴露時間或療效的關系

〔ArakawaM, et al. Exp Ther Med,2011,2(5):901-905〕

本項研究評估蒽環(huán)類藥物吡柔比星(THP)TURBT術后即刻單次膀胱灌注用于治療淺表性膀胱癌時，局部組織中藥物濃度和暴露時間或療效的關系。

研究入組22例淺表性膀胱癌患者(中低危)經單次膀胱灌注THP(30 mg)治療，間隔一定時間后檢測腫瘤組織和血液中THP的濃度。在膀胱癌腫瘤組織中可以檢測到不同濃度(范圍：2.3～125 μg/g組織)THP，而在血液中沒有檢測到THP。

在30 min內，腫瘤組織中THP的濃度隨著暴露時間延長而增加，而與腫瘤大小相關性小。TURBT術后腫瘤膀胱灌注THP，沒有發(fā)現組織濃度與預防術后膀胱內復發(fā)存在顯著的相關性。所有患者均沒有發(fā)現與THP治療相關的嚴重不良反應，如膀胱刺激征、局部毒性等。

本研究提示，對于淺表性膀胱癌患者，在膀胱灌注THP時，應該考慮藥物暴露時間和腫瘤大小的影響。腫瘤組織藥物濃度隨著暴露時間的延長而增加，30 min達到最大濃度。

(深圳萬樂藥業(yè)有限公司學術部摘譯)

030001太原，山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院

王東文，E-mail:urology2007@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2015.06.016

2015-06-16)