胡 娜 封洲燕 郭哲杉 王兆祥 余 穎

(浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，杭州 310027)

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深部腦刺激中單相脈沖與雙相脈沖的作用比較

胡 娜 封洲燕*郭哲杉 王兆祥 余 穎

(浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，杭州 310027)

深部腦刺激在帕金森和癲癇等腦部疾病治療中的應(yīng)用不斷發(fā)展，它使用的電刺激波形通常為窄脈沖。但是，對于單相脈沖與雙相脈沖的刺激作用之間的差別還缺乏全面的認(rèn)識。為了研究不同波形脈沖對于深部腦組織的刺激作用，在麻醉大鼠海馬CA1區(qū)的輸入和輸出軸突纖維上，分別施加不同極性的或者不同方式的(單個或連續(xù))單相和雙相脈沖，考察CA1區(qū)神經(jīng)元單細(xì)胞和神經(jīng)元群體在刺激作用下的響應(yīng)，以定量分析不同刺激波形的作用效果。共計18次動物實驗結(jié)果如下：1)CA1區(qū)輸入通道的小強度單個刺激順向誘發(fā)單元鋒電位時，以興奮性相位為前相的雙相脈沖和興奮性單相脈沖的誘發(fā)率(分別為69.2%±10.4% 和65.0%±10%)顯著高于以非興奮性相位為前相的雙相脈沖和非興奮性單相脈沖的誘發(fā)率(分別為28.8%±9.5%和34.2%±12.5%)(n=6)；而且，雙相脈沖的作用效果取決于前相，與無后相的單相脈沖的作用效果沒有顯著差別。2)CA1區(qū)輸出通道的大強度單個刺激逆向誘發(fā)群峰電位時，雙相脈沖的作用仍然與單相脈沖接近(n=6)，由其前相主導(dǎo)，后相的作用較小。3)在CA1區(qū)輸出通道逆向的100 Hz持續(xù)高頻串刺激期間，起始0.5 s時間內(nèi)單相脈沖引起群峰電位的幅值下降(54.2%±21.3%)顯著高于前相與其一致的雙相脈沖所引起的幅值下降(39.0%±10.2%)(n=6)，說明高頻串刺激時單相脈沖的作用比雙相脈沖要強，但是單相脈沖可能造成神經(jīng)組織的損傷。因此，長時間的高頻刺激治療應(yīng)采用雙相脈沖。這些研究結(jié)果對于深入了解深部腦刺激的作用機制以及安全有效地推廣其臨床應(yīng)用都具有重要意義。

深部腦刺激；脈沖相位；高頻刺激；單元鋒電位；群峰電位

引言

近年來，深部腦刺激(deep brain stimulation，DBS)在臨床上越來越多地被用于治療各種腦部疾病，例如帕金森病、癲癇、記憶衰退等[1-3]。在DBS的應(yīng)用中，電刺激各項參數(shù)的選擇(包括刺激波形、強度、頻率和時長等)對于DBS的安全性和有效性極其重要[4-5]。由于脈沖波形對于神經(jīng)和肌肉等可興奮組織的激活效果比較好，因此在DBS中最為常用。前人的研究結(jié)果已證實，采用單極刺激電極時單相脈沖誘發(fā)動作電位的效果較好，但是其“電荷積累”效應(yīng)會對被刺激神經(jīng)組織造成損傷[6]。而雙相脈沖可以達到電荷平衡，減少電刺激對于組織的損傷。有關(guān)視網(wǎng)膜神經(jīng)和聽覺神經(jīng)的電刺激實驗研究已表明，雙相脈沖是電刺激治療視覺和聽覺障礙的最佳選擇[7-9]。但是，在DBS中單相脈沖與雙相脈沖刺激之間的差別究竟怎樣還沒有明確的定論。而且，DBS的臨床治療通常采用植入電極中的兩個位點進行雙極刺激[10]，在這種情況下，刺激脈沖的極性以及不同極性在雙相脈沖中出現(xiàn)的順序?qū)τ诖碳さ淖饔眯Ч欠翊嬖诓顒e？對于單個刺激和持續(xù)的高頻刺激，單相脈沖與雙相脈沖的刺激之間又是否有差別？這些問題的答案都仍然不明確，而它們對于DBS臨床應(yīng)用的安全性和有效性至關(guān)重要。

為了研究這些問題，本研究將不同極性的單相和雙相恒流脈沖施加于麻醉大鼠海馬CA1區(qū)的輸入和輸出軸突纖維上，通過考察CA1區(qū)神經(jīng)元單個細(xì)胞和細(xì)胞群體的誘發(fā)響應(yīng)，來分析小強度、大強度以及單個脈沖刺激、持續(xù)高頻串刺激等不同情況下單相和雙相脈沖刺激作用之間的差別。本文選擇海馬區(qū)軸突纖維作為刺激目標(biāo)是因為大腦海馬區(qū)對于學(xué)習(xí)記憶、空間定位和認(rèn)知等方面都具有重要作用，而且是DBS治療癲癇和智障等疾病的重要刺激目標(biāo)之一[11]；此外，腦內(nèi)軸突纖維所占據(jù)的空間遠(yuǎn)大于神經(jīng)元胞體等其他部位[12]，軸突纖維是DBS作用的重要部位。因此，本研究對于海馬區(qū)軸突纖維的電刺激研究結(jié)果不僅可以為臨床DBS的刺激波形選擇提供重要依據(jù)，而且有助于深入揭示不同刺激波形對于腦內(nèi)神經(jīng)組織的作用機制，促進DBS的臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 動物手術(shù)和電極植入

成年Sprague-Dawley大鼠18只(250～300 g，購自浙江省實驗動物中心)，腹腔注射烏拉坦(Urethane)1.25 g/kg麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上。切開鼻部皮膚，在鼻骨上鉆兩個小孔，用不銹鋼螺釘分別將參考電極和接地電極固定在鼻骨上。然后，切開頭部皮膚，除去部分顱骨和硬腦膜，插入記錄電極和刺激電極[13]。

記錄電極采用美國Neuro-Nexus Technologies公司生產(chǎn)的16通道微電極陣列，將其植入至海馬CA1區(qū)胞體層，定位是前囟后3.5 mm，旁開2.7 mm，大腦皮層表面向下深2.5～3.0 mm。刺激電極使用美國FHC公司生產(chǎn)的雙極同心電極，型號為CBCSG75。將兩根刺激電極分別植入到海馬CA1區(qū)的輸入通路Schaffer側(cè)支和CA1區(qū)的輸出通路Alveus軸突纖維上，它們分別用于順向(Orthodromically，O)刺激和逆向(Antidromically，A)刺激來激活CA1區(qū)的神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位。其中，順向刺激電極的定位是前囟后2.2 mm，旁開2.0 mm，深約2.8 mm；逆向刺激電極的定位是前囟后4.8 mm，旁開2.7 mm，深為2.0～2.5 mm[13]。

1.2 記錄和刺激

記錄電極采集的電信號，經(jīng)過3600型細(xì)胞外放大器(A-M System Inc.，美國)放大之后，用Powerlab 16/30型多通道信號采集系統(tǒng)(AD Instruments，pty Ltd，澳大利亞)以20 kHz的頻率進行A/D轉(zhuǎn)換(分辨率為16位)。采樣后的數(shù)據(jù)存入硬盤，用于離線分析。放大器的頻響范圍設(shè)定為0.3～5000 Hz，放大倍數(shù)為100倍。

細(xì)胞外的負(fù)脈沖電位會導(dǎo)致鄰近細(xì)胞膜的去極化，產(chǎn)生興奮；反之，細(xì)胞外的正脈沖電位卻會導(dǎo)致鄰近細(xì)胞膜的超極化[6]。本研究采用雙極同心刺激電極，所述的刺激脈沖的正、負(fù)極性均指雙極電極的內(nèi)芯端輸出波形的極性，而電極外端的極性與之正好相反。這使得不同極性電刺激的作用效果與刺激目標(biāo)靠近哪個電極端有關(guān)。如圖1所示，當(dāng)被刺激的軸突更靠近刺激電極的內(nèi)芯端時，該端輸出負(fù)脈沖比正脈沖更容易激活軸突(見圖1(a))；反之，當(dāng)被刺激的軸突更靠近刺激電極的外端時，外端輸出負(fù)脈沖比較容易激活軸突，而此時內(nèi)芯端輸出的是正脈沖(見圖1(b))。為了深入比較正、負(fù)脈沖的刺激作用效果，每次實驗時將誘發(fā)動作電位作用較強的單相脈沖的相位定義為該次實驗的興奮性相位(excitatory phase)，與之相反的相位則稱為非興奮性相位(non-excitatory phase)。據(jù)此，將兩種不同極性的單相脈沖分別稱為興奮性單相脈沖和非興奮性單相脈沖；并且，將以興奮性相位為前相的雙相脈沖稱為興奮性雙相脈沖，以非興奮性相位為前相的雙相脈沖則稱為非興奮性雙相脈沖[9]。

圖1 正、負(fù)極性脈沖的作用效果取決于雙極刺激電極與被刺激軸突之間的相對位置。(a)軸突靠近刺激電極的內(nèi)芯端時，該端輸出負(fù)脈沖比正脈沖更容易激活軸突；(b)軸突靠近刺激電極的外端時，內(nèi)芯端輸出正脈沖更容易激活軸突Fig.1 Stimulation effect of anodic and cathodic pulses depend on the spatial relationship between the target axons and the bipolar stimulating electrode.(a) Cathodic pulses delivered by the inner pole of the electrode tend to activate axons more easily than anodic pulses if the axons is closer to the inner pole; (b) Anodic pulses delivered by the inner pole tend to activate axons more easily than cathodic pulses if the axons is closer to the outer pole

1.3 電刺激作用效果的評價指標(biāo)

軸突在電刺激作用下誘發(fā)產(chǎn)生的動作電位會沿著軸突向下游(順向)和上游(逆向)兩個方向傳播，進而激活位于刺激下游和上游的神經(jīng)元。因此，在海馬CA1區(qū)的輸入通路Schaffer側(cè)支上施加電刺激時，可以順向激活下游CA1區(qū)的神經(jīng)元(見圖2(a))；在CA1區(qū)的輸出通路Alveus纖維上施加電刺激時，可以逆向激活上游CA1區(qū)的神經(jīng)元(見圖4(a))。較小的刺激強度可以誘發(fā)單個神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，即鋒電位(spike)；較大的刺激強度則可以誘發(fā)大量神經(jīng)元同步產(chǎn)生動作電位，即群峰電位(population spike，PS)。利用CA1區(qū)順向和逆向刺激的如下定量指標(biāo)來考察不同脈沖波形的刺激作用效果。

1)較小強度的順向單個刺激作用下，CA1區(qū)spike的誘發(fā)率、誘發(fā)閾值(即誘發(fā)率達到50%的刺激強度)以及閾上刺激誘發(fā)spike的潛伏期(spike latency，SL)[14]，即刺激誘發(fā)的第一個spike與刺激脈沖之間的時間距離。

2)較大強度的逆向單個刺激作用下，CA1區(qū)誘發(fā)的逆向群峰電位(antidromically-evoked population spike，APS)的幅值。

3)逆向高頻刺激(high-frequency stimulation，HFS)過程中APS的幅值衰減速率。

實驗數(shù)據(jù)均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n表示實驗次數(shù)，即動物數(shù)量)，利用統(tǒng)計學(xué)的方差分析(ANOVA)和Post hoc Bonferroni檢驗或者配對t檢驗來比較各組數(shù)據(jù)之間差別的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同脈沖波形的小強度單個刺激作用的比較

無外加刺激時，CA1區(qū)神經(jīng)元的spike處于“隨機”發(fā)放的狀態(tài)。在海馬區(qū)Schaffer側(cè)支上施加一定強度的順向單個電刺激脈沖后(見圖2(a))，在CA1區(qū)就會記錄到緊跟刺激偽跡之后的神經(jīng)元spike(見圖2(b))。由于順向電刺激經(jīng)過軸突和突觸的傳導(dǎo)，才能誘發(fā)下游神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，spike的潛伏期在2～10 ms范圍之內(nèi)[15]。因此，將刺激脈沖發(fā)生時刻設(shè)定為0，測量刺激后2～30 ms這個較大時間范圍內(nèi)出現(xiàn)的第一個spike的時間(不妨先稱為“潛伏期”)，從而統(tǒng)計分析不同脈沖波形誘發(fā)spike的情況。不同神經(jīng)元的潛伏期有所不同[7]，但同一個神經(jīng)元被來自同一電極的作用激活時，spike的潛伏期很相似。本研究根據(jù)多通道記錄信號，在每次實驗中識別并計算同一個神經(jīng)元所產(chǎn)生的單元spike的潛伏期[16]。

圖2(c)～(e)是其中一次實驗的示例，是4種不同刺激波形(見圖中每行左側(cè)的圖標(biāo))和3種不同刺激強度作用下的40次重復(fù)刺激中某個神經(jīng)元spike的潛伏期散點圖，重復(fù)刺激的時間間隔為5 s。從中可見，對于同樣的脈沖波形，當(dāng)刺激強度較小(20 μA)時，潛伏期的散點圖很分散，表明這些spike并不是刺激誘發(fā)的，而是自發(fā)的。隨著刺激強度的逐漸增加，潛伏期的變化范圍逐漸縮小，其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差都逐漸減小(見各子圖上方)。當(dāng)刺激強度增加至35 μA時，無論哪種刺激波形，誘發(fā)的spike都“聚攏”在狹窄的時間窗內(nèi)，表明刺激強度已超過閾值，spike幾乎都是刺激誘發(fā)產(chǎn)生。

為了比較相同刺激強度下不同脈沖波形誘發(fā)spike的差別，將每次動物實驗中興奮性單相脈沖的稍大于閾值的刺激強度設(shè)為基準(zhǔn)，即誘發(fā)率剛超過50%時的刺激強度，記為Ib；然后，分4個檔次的刺激強度：Ib-5 μA、Ib、Ib+10 μA和Ib+(10～50 μA)，分別考察不同脈沖波形在40次重復(fù)刺激中的spike誘發(fā)率。結(jié)果顯示：每種刺激波形的誘發(fā)率都隨著刺激強度的增加而升高(見圖3(a))。在刺激閾值附近，6次動物實驗的統(tǒng)計學(xué)方差分析結(jié)果表明(見圖3(b))，興奮性單、雙相脈沖波形的誘發(fā)率(分別為65.0%±10.0%和69.2%±10.4%，n=6)顯著高于相應(yīng)的非興奮性單、雙相脈沖波形的誘發(fā)率(分別為34.2%±12.5%和28.8%±9.5%，n=6)。但是，當(dāng)刺激強度離開閾值(小于或者大于閾值)時，這種差別明顯減小。這表明刺激強度較小時，4種波形都趨于無法誘發(fā)spike；反之，刺激強度較大時，4種波形都趨于足以誘發(fā)spike；僅在閾值附近它們的差別最大。而單相脈沖的誘發(fā)率與以其為前相的雙相脈沖的誘發(fā)率之間沒有顯著差別(見圖3(a)和(b))。此外，方差分析結(jié)果表明，在刺激強度足夠大的閾上刺激作用下，4種波形誘發(fā)spike的潛伏期沒有顯著差別(見圖3(c))；表明各種刺激誘發(fā)spike的過程相似。

這些結(jié)果表明，幾十μA的小強度刺激時，雙相脈沖對于細(xì)胞膜起興奮作用的主要是前相，后相幾乎不起作用。但是，在DBS應(yīng)用中，必須施加較大強度的刺激，以便激活大量神經(jīng)元，才能取得療效；因此，僅研究較大刺激強度時不同脈沖波形的作用效果。

2.2 不同脈沖波形的大強度單個刺激作用的比較

如圖4(a)所示，在海馬CA1區(qū)Alveus纖維上施加逆向刺激時，可以在CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的胞體層誘發(fā)出群峰電位APS(見圖4(b))。群峰電位是細(xì)胞外記錄的神經(jīng)元群體同步發(fā)放的動作電位整合信號，其幅值大小與所興奮的神經(jīng)元數(shù)量成正比[17]，因此，通過比較相同刺激強度所誘發(fā)的APS幅值的大小，可以考察不同脈沖波形的刺激作用效果。

圖2 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對于小強度順向單刺激的響應(yīng)。(a)海馬CA1區(qū)神經(jīng)回路示意圖以及記錄電極和順向刺激電極的位置；(b)刺激前后神經(jīng)元的spike發(fā)放、緊隨刺激后的第一個spike信號放大圖以及spike的潛伏期定義,“▼”表示刺激偽跡；(c)～(e)刺激強度分別為20、25、35 μA時4種不同脈沖刺激之后第一個spike的潛伏期散點圖。其中各子圖表示5 s一次的40次重復(fù)刺激的數(shù)據(jù)，子圖中標(biāo)注了相應(yīng)刺激強度下spike的誘發(fā)率(evoked ratio，ER)和潛伏期(mean latency，ML)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。由于“潛伏期”大于30 ms的spike沒有顯示，刺激強度較小時子圖的散點數(shù)量可能小于40個Fig.2 Responses of neurons to single orthodromic stimuli with low intensity in the hippocampal CA1 region. (a) Schematic diagram of the neuronal networks and the placements of the recording electrode and the orthodromic stimulation electrode；(b) Spike firings of neurons before and after stimulation, the expanded drawing of the first spike immediately following stimulation and the definition of spike latency；(c)～ (e) Scatter plots of the first spike latency following the stimulating pulses with 4 different waveforms and increasing intensities (20，25，35 μA). Each scatter plot includes the latencies of 40 repeated stimulations with an inter-pulse interval of 5 s. The evoked ratio and mean latency (mean±standard deviation) under the given stimulation intensity are shown within each plot. Because the spikes with latency longer than 30 ms are not shown, the number of dots in the plots may be less than 40

圖3 小強度刺激下4種不同脈沖的spike誘發(fā)率和spike平均潛伏期的比較。(a)spike誘發(fā)率隨刺激強度的變化，n=6；(b)刺激強度為Ib時4種脈沖的spike誘發(fā)率比較，ANOVA：F=22.7，**P<0.001，Bonferroni兩兩比較檢驗，n=6；(c)閾上刺激(≥Ib+10)時4種脈沖誘發(fā)spike的平均潛伏期比較，ANOVA：F=1.7，P>0.05，n=6Fig.3 Comparison of evoked ratios and mean latencies of the spikes evoked by 4 different stimulation pulses with small intensities. (a) Changes of evoked ratios of spikes with increasing intensity, n=6; (b) Comparison of evoked ratios of spikes among 4 different stimulation pulses with a given intensity of Ib, ANOVA: F=22.7，**P<0.001, Bonferroni Post Hoc tests, n=6; (c) Comparison of mean latencies of the spikes among 4 different stimulation pulses with a super-threshold intensity(≥Ib+10)，ANOVA：F=1.7，P>0.05，n=6

圖4(c)所示是6只大鼠實驗中刺激強度從0.1 mA遞增至1.0 mA時，4種脈沖波形誘發(fā)的APS幅值的比較。可見，隨著刺激強度的增加，APS幅值也逐漸增大。而且，重復(fù)測量雙因素方差分析結(jié)果表明，不同脈沖波形誘發(fā)的APS幅值之間存在顯著差別：興奮性單相和雙相脈沖誘發(fā)的APS幅值都顯著大于非興奮性單相和雙相脈沖。并且，非興奮性雙相脈沖誘發(fā)的APS幅值顯著大于非興奮性單相脈沖，而興奮性單相脈沖與雙相脈沖之間無顯著差別。這表明，在大強度刺激作用下，對于興奮相為前相的脈沖，雙相脈沖與單相脈沖的誘發(fā)能力相似，這與本文2.1節(jié)的小強度刺激的結(jié)果一致。而對于非興奮相為前相的雙相脈沖，其興奮性后相會顯著增強脈沖誘發(fā)APS的能力，這與小強度刺激有所不同。

以上為單個刺激作用效果的研究。由于DBS通常使用長時間的高頻刺激脈沖串，因此，下面考察高頻刺激時單相脈沖與雙相脈沖作用效果之間的差別。

圖4 不同脈沖波形在海馬CA1區(qū)逆向誘發(fā)群峰電位的比較。(a)海馬CA1區(qū)逆向刺激電極位置；(b)逆向脈沖刺激誘發(fā)的群峰電位APS及其幅值定義；(c)刺激強度為0.1～1.0 mA時不同脈沖波形誘發(fā)的APS幅值的比較。重復(fù)測量ANOVA：F=34.4，*P<0.05;**P<0.001, Bonferroni兩兩比較檢驗，n=6Fig.4 Comparison of antidromic population spikes evoked by different stimulation pulses in the hippocampal CA1 region. (a) Schematic diagram and the placement of antidromic stimulation electrode in the hippocampal CA1 region；(b) Antidromically-evocked population spike (APS) and the definition of APS amplitude; (c) Comparison of the APS amplitudes among the different stimulation pulses with the intensities increased from 0.1 to 1.0 mA. Repeated measures ANOVA: F=34.4，*P<0.05;**P<0.001, Bonferroni Post Hoc tests, n=6

2.3 單相與雙相脈沖高頻刺激串作用的比較

圖5是實驗示例，在海馬CA1區(qū)Alveus軸突纖維上分別施加100 Hz的高頻單相脈沖和雙相脈沖(其前相與單相脈沖一致)，持續(xù)時間為1 min，刺激強度設(shè)為能夠誘發(fā)出75%最大APS幅值的電流，約為0.3～0.5 mA[18]。從去刺激偽跡的記錄信號中可見，在雙相高頻刺激的起始數(shù)秒時間內(nèi)，誘發(fā)的APS的幅值由10 mV迅速減小為2 mV(見圖5(a))，且在之后的長時間刺激過程中均保持于小幅值的水平(見圖5(c)、(e))。已有的研究表明，這種APS幅值的減小是由于高頻電刺激導(dǎo)致的軸突傳導(dǎo)阻滯[18-19]。圖5(b)所示的單相脈沖高頻刺激不僅使得APS幅值迅速減小，而且還誘發(fā)了擴散性抑制(spreading depression)[20](虛線框內(nèi)所示)，使得APS完全消失(見圖5(b)和(d))。在總計6只大鼠實驗的12次、1 min高頻刺激(100與200 Hz各6次)中，有4次單相脈沖刺激誘發(fā)了這種擴散性抑制，其中包括1次100 Hz和3次200 Hz的刺激。而雙相脈沖高頻刺激未見誘發(fā)擴散性抑制。這表明，長時間單相脈沖的高頻刺激會導(dǎo)致神經(jīng)組織的損傷。

圖5 高頻長時間刺激期間雙相與單相脈沖作用效果的比較。(a)和(b)分別為雙相脈沖(先負(fù)后正)和單相負(fù)脈沖的高頻刺激期間的去除偽跡記錄信號，信號上方的橫杠表示1 min刺激時長；(c)和(d)分別為(a)和(b)兩串刺激期間每個脈沖誘發(fā)的APS的歸一化幅值(即每個APS幅值與第一個APS幅值的百分比值)；(e)和(f)分別為(c)和(d)的0～2 s時間段的放大圖，其中ΔA為刺激起始的0.5 s時間內(nèi)APS幅值下降的百分比Fig.5 Comparison of the effect of monophasic and biphasic high-frequency stimulation. The first row shows the potential recordings (with stimulation artifacts removed) during a 1 min long period of 100 Hz stimulation with (a) biphasic pulses (cathodic first) and (b) cathodic monophasic pulses; (c) and (d) show the normalized amplitudes of each APS evoked during the stimulation periods and showed in the plots (a) and (b) respectively; (e) and (f) show the time expanded plots of the first 2 s stimulation periods in the plots (c) and (d) respectively. ΔA is the percentage of APS amplitude decrease during the first 0.5 s of stimulation periods

為了比較在高頻刺激的起始段單相和雙相脈沖引起軸突傳導(dǎo)阻滯的快慢，計算刺激起始的0.5 s時間內(nèi)APS幅值下降的百分占比ΔA(見圖5(e)、(f))。鑒于臨床DBS的常用刺激頻率在100～200 Hz之間[21-22]，分別進行了100 和200 Hz兩種刺激頻率的高頻刺激。如圖6所示，在各6次實驗中，刺激頻率為100 Hz時，單相脈沖對于APS幅值的衰減率(54.2%±21.3%，n=6)顯著高于前相與其一致的雙相脈沖(39.0%±10.2%，n=6)；而刺激頻率為200 Hz時，單相脈沖與雙相脈沖之間的差別卻不顯著。這表明，100 Hz頻率下單相脈沖比雙相脈沖更容易阻滯軸突的傳導(dǎo)。

圖6 高頻刺激(100和200 Hz)起始段雙相脈沖與單相脈沖抑制APS幅值的比較(ΔA為刺激起始的0.5 s時間內(nèi)APS幅值下降的百分占比(見圖5(c)和(f))。*配對t檢驗， P=0.013，n=6)Fig.6 Comparison of the suppression of APS amplitudes during the onsets of 100 and 200 Hz high-frequency stimulation between biphasic and monophasic stimuli(ΔA is the percentage of APS amplitude decrease that is denoted in Fig.5(e) and (f).*paired-t test, P=0.013, n=6)

3 討論

本課題從3個方面研究了單相與雙相脈沖刺激作用效率之間的差別：小強度刺激誘發(fā)單個神經(jīng)元鋒電位，大強度刺激誘發(fā)神經(jīng)元群體的群峰電位，高頻持續(xù)刺激過程中神經(jīng)元群峰電位衰減。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：一是對于常用的0.1 ms脈沖寬度，無論刺激強度的大小，單個脈沖刺激誘發(fā)神經(jīng)元響應(yīng)時，雙相脈沖的作用效率主要取決于其前相；僅當(dāng)前相為非興奮相時，起電荷平衡作用的后相(此時為興奮相)才有增強刺激效率的作用。二是在高頻持續(xù)刺激時，單相脈沖串阻滯軸突傳導(dǎo)的速度比前相與其一致的雙相脈沖要快，但單相脈沖對于神經(jīng)組織的損傷比較大。這些現(xiàn)象的可能機制分析如下。

已有的研究指出，動作電位的產(chǎn)生過程并非絕對遵循“全或無”規(guī)則，其去極化和復(fù)極化的初始階段都有可能因為受到超極化電位的干擾而中斷。因此，在電荷平衡的雙相脈沖刺激中，前相產(chǎn)生的動作電位有可能被后相所中斷[23]。但是，對于腦內(nèi)組織的有髓鞘神經(jīng)纖維而言，有可能受到干擾的所謂動作電位的“脆弱期”的時長僅有100 μs左右[24]。而且，對于刺激強度較大的閾上刺激，“脆弱期”幾乎不存在，即便是雙相脈沖中緊跟前相出現(xiàn)的后相也不會對前相的作用產(chǎn)生影響[24]。因此，本研究在海馬區(qū)軸突纖維上施加100 μs脈寬的雙相脈沖時，后相出現(xiàn)的時刻可能已經(jīng)錯過了前相的“脆弱期”，所以，雙相脈沖的作用主要由其前相決定。而當(dāng)大強度刺激誘發(fā)群峰電位APS時，由于神經(jīng)元群體中各個神經(jīng)元單體與刺激電極之間的距離不同，動作電位的誘發(fā)閾值也有所不同；因此，當(dāng)雙相脈沖的前相為作用效果較弱的非興奮相時，一部分未能被前相激活的閾值較高的神經(jīng)元可能被接踵而至的興奮相激活，從而使得這種雙相脈沖的作用效率高于非興奮性單相脈沖(見圖4(c))。

多數(shù)DBS的臨床治療都采用100～200 Hz的頻率恒定的高頻刺激序列。本文的研究結(jié)果表明，此頻率范圍內(nèi)的單相脈沖序列比雙相脈沖序列的作用效果要強，可以更快速地導(dǎo)致軸突傳導(dǎo)的阻滯，即在高頻刺激起始時期單相脈沖能夠產(chǎn)生更大的APS降幅ΔA(見圖6)。先前的研究已經(jīng)指出，高頻刺激引起軸突阻滯的重要機制可能是細(xì)胞膜高頻率發(fā)放動作電位導(dǎo)致了細(xì)胞外鉀離子濃度([K+]o)的升高[19]。此外，組織受損也會使得[K+]o升高[6]。而單相脈沖高頻刺激比雙相脈沖高頻刺激更容易造成組織損傷[25]，這說明單相刺激可能由于組織損傷而進一步增加[K+]o。在實驗中觀察到的單相高頻刺激串容易引起擴散性抑制的現(xiàn)象也佐證了這一點，因為[K+]o過高被認(rèn)為是導(dǎo)致擴散性抑制產(chǎn)生的原因之一[26]。因此，可以推測，單相高頻刺激期間[K+]o升高的速度要比雙相刺激時更快，從而能夠加速軸突傳導(dǎo)阻滯的發(fā)生。又由于刺激頻率越高軸突阻滯得越快[18]，在200 Hz時軸突阻滯幾乎瞬間就能完成(<0.5 s)；因此，在200 Hz時，單相刺激與雙相刺激之間的差別就沒有100 Hz時那么顯著。

4 結(jié)論

本課題對于大鼠海馬CA1區(qū)軸突纖維的電刺激研究結(jié)果表明，無論前相極性如何，單個雙相恒流脈沖的刺激作用與無后相的單相恒流脈沖相似；而高頻刺激下，雖然單相脈沖對神經(jīng)元群體的作用要強于雙相脈沖；但是，單相脈沖可能造成神經(jīng)組織的損傷。因此，在長時間高頻刺激的DBS治療中應(yīng)該采用雙相脈沖。這些研究結(jié)果為安全、高效地推廣深部腦刺激在臨床腦疾病治療中的應(yīng)用提供了重要的依據(jù)。

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Different Stimulation Effects between Monophasic Pulses and Biphasic Pulses in Deep Brain Stimulation

Hu Na Feng Zhouyan*Guo Zheshan Wang Zhaoxiang Yu Ying

(CollegeofBiomedicalEngineeringandInstrumentationScience,KeyLabforBiomedicalEngineeringofEducationMinistry,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)

Deep brain stimulation (DBS) has been developed for treating brain diseases such as Parkinson's disease and epilepsy. Narrow pulses are the most commonly used stimulation waveforms of DBS. However, the differences between the stimulation effects of monophasic pulses and biphasic pulses are not clear yet. To investigate the different stimulation effects on deep brain tissue by different pulse waveforms, monophasic and biphasic pulses with different polarity and different patterns (single or train) were respectively applied in the afferent fibers and the efferent fibers of the hippocampus CA1 region in anaesthetized rats. Responses of single neurons and neuronal populations in the CA1 region were examined to quantitatively analyze the effect of different stimulation waveforms. Results of total 18 animal experiments were shown as following: 1) For single pulses stimulation with low intensity on the afferent fibers to evoke unit spikes orthodromically in the CA1 region, the evoked ratios of excitatory-phase-first biphasic and excitatory-phase monophasic were 69.2%±10.4% and 65.0%±10% (n=6), respectively. These ratios were significantly higher than the evoked ratios of non-excitatory-phase-first biphasic and non-excitatory-phase monophasic: 28.8%±9.5% and 34.2%±12.5% (n=6), respectively. In addition, the stimulation effect of biphasic pulses was dominated by first phases and was not significantly different from the effect of monophasic pulses without second phases. 2) For single pulses on the efferent fibers to evoke population spikes antidromically in the CA1 region, the stimulation effect of biphasic pulses was still similar to the effect of monophasic pulses without second phases (n=6). The effect of biphasic pulses was dominated by their first phases without significant effects of the second phases. 3) During 100 Hz high-frequency antidromic stimulations on the efferent fibers of CA1 region, in the 0.5 s period at the beginning of stimulation, the amplitude suppression of population spikes induced by monophasic pulses was 54.2%±21.3% and was significantly higher than the suppression induced by biphasic pulses 39.0%±10.2% (n=6). It was indicated that the effect of monophasic pulses was much stronger than the effect of biphasic pulses during high-frequency stimulations. However, trains of high-frequency monophasic pulses tended to cause damages to neuronal tissues. Therefore, biphasic pulse is more suitable for chronic therapy with high-frequency stimulation. These results are important for the further understanding of DBS mechanisms and for the efficiency and safety of wide applications of DBS in clinic.

deep brain stimulation; pulse phase; high-frequency stimulation; unit spike; population spike

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 05.005

2015-02-03， 錄用日期:2015-07-31

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2011CB504400)

R338；R318

A

0258-8021(2015) 05-0548-10

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: fengzhouyan@139.com