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強(qiáng)直性脊柱炎患者不同活動(dòng)期Treg、Th17細(xì)胞的臨床意義及其相關(guān)性*

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150113.1835.008.html

王作龍1, 鐘乃風(fēng)2, 馬莉1**

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附院 中心實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 生物與工程學(xué)院生物技術(shù)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 探討強(qiáng)直性脊柱炎(AS)不同活動(dòng)期調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)的臨床意義，分析兩者之間的相關(guān)性。方法: 78例AS患者(AS組)分為低活動(dòng)性AS組和高活動(dòng)性AS組，30例健康體檢者作為對(duì)照組，抽取兩組受檢者外周血，應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)因子染色技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量，分析Treg和Th17與AS活動(dòng)性的相關(guān)性。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，AS組和低活動(dòng)性AS組外周血Treg細(xì)胞百分率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高活動(dòng)性AS組外周血Treg細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.01)，AS組外周血Th17細(xì)胞百分率增高(P<0.01)，且低活動(dòng)性AS組和高活動(dòng)性AS組外周血Th17細(xì)胞百分率均增高(P<0.05)，AS組、低活動(dòng)性AS組以及高活動(dòng)性AS組外周血Th17/Treg的細(xì)胞比值均有增高(P<0.01)；與低活動(dòng)性AS組相比，高活動(dòng)性AS組外周血Treg細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，高活動(dòng)性AS組外周血Th17細(xì)胞明顯增高(P<0.01)，高活動(dòng)性AS組外周血Th17/Treg的細(xì)胞比率明顯增高(P<0.01)；相關(guān)性分析顯示，AS患者外周血Th17細(xì)胞比例與Bath強(qiáng)直性脊柱炎病情活動(dòng)指數(shù)(BASDI)呈正相關(guān)，(r=0.409)Treg細(xì)胞比例與BASDI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.265)，Th17/Treg比率與BASDI相關(guān)性分析呈顯著正相關(guān)(r=0.459，P<0.01)。結(jié)論: AS患者外周血Treg、Th17細(xì)胞數(shù)量的改變，與AS的發(fā)生、發(fā)展有明顯相關(guān)性，檢測(cè)AS患者外周血Treg、Th17細(xì)胞的數(shù)量以及Thl7/Treg的比率有助于AS病情的判斷。

[關(guān)鍵詞]輔助性T細(xì)胞17； 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 脊柱炎，強(qiáng)直性； 免疫，細(xì)胞； 自身免疫疾病

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性自身免疫性疾病,其準(zhǔn)確的發(fā)病機(jī)理目前尚未可知[1]。病因有遺傳假說(shuō)、DNA甲基化、細(xì)菌感染假說(shuō)、免疫假說(shuō)，未折疊蛋白反應(yīng)假說(shuō)等[2-3]。有文獻(xiàn)報(bào)道在AS的發(fā)生和發(fā)展中，T細(xì)胞亞群失衡起到了關(guān)鍵作用[4]。按照 CD4+T 細(xì)胞分化和功能性將其分為輔助性T細(xì)胞17(Th17)及發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)等亞群。有研究發(fā)現(xiàn)AS患者外周血Th17細(xì)胞明顯增高而Treg細(xì)胞降低，本研究通過(guò)檢測(cè)AS患者外周血中Treg、Th17及其Th17/Treg比率，分析其與AS活動(dòng)性的相關(guān)性，為AS的臨床診斷及治療提供新思路和新方法。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象

78例AS患者作為研究組，30例健康體檢者作為對(duì)照組。AS患者中男性65例，女性13例，年齡17～53歲，平均(26±7.8)歲；患者均為HLA-B27陽(yáng)性，均符合1984年紐約修訂的AS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均未經(jīng)任何治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：就診前6個(gè)月內(nèi)未用過(guò)糖皮質(zhì)激素，排除合并其他與AS相關(guān)的疾病(肝硬化、腫瘤等)，無(wú)風(fēng)濕病及其他自身免疫病。抽血前，所有AS受試者均自愿簽署知情同意書(shū)，填寫(xiě)病例調(diào)查表以及Bath AS功能指數(shù)(BASFI)、Bath AS病情活動(dòng)指數(shù)(BASDAI)表格。依據(jù)Bath AS病情活動(dòng)指數(shù)，將AS組分為低活動(dòng)性AS組(BASDI<4分，44例)、高活動(dòng)性AS組(BASDI≥4分，34例)。兩組患者年齡及性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.815)。30名健康體檢者中男性16名、女性14名，年齡15～52歲，平均(25±8)歲，無(wú)HIV感染，無(wú)重大疾病史。對(duì)照組與AS組年齡及性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集受檢者均于早上8～10時(shí)空腹抽取靜脈血2～3 mL于EDTA-K2抗凝管中，2 h內(nèi)檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞體外刺激活化取上述經(jīng)EDTA-K2抗凝的靜脈血，用淋巴細(xì)胞液分離密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，RPMI 1 640調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL,接種于6孔培養(yǎng)板，加入莫能霉素，使最終濃度分別為1.7 g/L、加入離子霉素，使最終濃度分別為1 g/L，加入佛波酯，使最終濃度分別為0.05 g/L。再進(jìn)行37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h。以上所用試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.3CD 69檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)CD3+CD8-T淋巴細(xì)胞膜表面的CD 69表達(dá)，以衡量激活效果。當(dāng)CD 69表達(dá)>90%(圖1)方可進(jìn)行Th17細(xì)胞的檢測(cè)。

1.2.4Th17細(xì)胞檢測(cè)取2支試管，標(biāo)記為同型管及陽(yáng)性管，并分別加入CD3-FITC、CD8-PECy7抗體各20 μL，然后加入已刺激培養(yǎng)5 h的全血50 μL，混勻，室溫避光孵育15 min；加入溶血素800 μL，混勻避光溶血3 min，再轉(zhuǎn)入37 ℃水浴箱中孵育5 min，加入PBS 1 mL，混勻后1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)1次。加入破膜劑1 mL，混勻，45 min破膜，1 000 r/min離心5 min，棄上清，對(duì)應(yīng)加入抗體標(biāo)記的同型對(duì)照(-)、Th17(+)，混勻，室溫避光孵育15 min；加入PBS緩沖液1 mL，充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)1次；棄上清液，加入適量PBS充分混勻，上機(jī)檢測(cè)。Th17細(xì)胞的結(jié)果分別以CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的百分率表示。

1.2.5Treg 細(xì)胞檢測(cè)取2支試管，第1管做同型對(duì)照并加入IgG1-APC、IgG2a-Alexflour672抗體20 μL，第2管加入Treg Cocktail(CD4-FITC、CD25-APC、CD127-Alexflour672)20 μL，再分別加入EDTA-K2抗凝外周血50 μL，漩渦混合器充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入800 μL溶血素，充分混勻，避光溶血3 min，再轉(zhuǎn)入37 ℃水浴箱中5 min，加入PBS緩沖液1 mL,1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)一次，棄上清液，加入適量PBS充分混勻，上機(jī)檢測(cè)。Treg細(xì)胞的結(jié)果以CD4+CD127LOWCD25+細(xì)胞的百分率表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1Th17、Treg細(xì)胞

與對(duì)照組相比，AS組和低活動(dòng)性AS組外周血Treg細(xì)胞百分率均無(wú)顯著差異(P>0.05)，高活動(dòng)性AS組外周血Treg細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AS組外周血Th17細(xì)胞百分率增高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且低活動(dòng)性AS組和高活動(dòng)性AS組外周血Th17細(xì)胞百分率均增高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AS組、低活動(dòng)性AS組、高活動(dòng)性AS組外周血Th17/Treg的細(xì)胞比值均增高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與低活動(dòng)性AS組相比，高活動(dòng)性AS組外周血Treg細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高活動(dòng)性AS組外周血Th17細(xì)胞百分率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，高活動(dòng)性AS組外周血Th17/Treg的細(xì)胞比值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1、圖2。

2.2Th17、Treg細(xì)胞與AS活動(dòng)性的相關(guān)性

AS患者外周血Th17細(xì)胞比例及Th17/Treg與Bath強(qiáng)直性脊柱炎病情活動(dòng)指數(shù)(BASDI)呈正相關(guān)(r=0.409,r=0.459，P<0.01)；Treg細(xì)胞比例與BASDI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.265，P<0.05)。

表1　AS組及正常對(duì)照組外周血中Treg、Th17細(xì)胞

(1)與正常對(duì)照組比較，P<0.01；(2)與低活動(dòng)性AS組比較，P<0.01

3討論

AS是一種嚴(yán)重的慢性炎性自身免疫性疾病，對(duì)患者的工作和生活造成了嚴(yán)重影響，同時(shí)也給患者的家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，多發(fā)于男性青壯年，發(fā)病的高峰年齡為20～30 歲。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞在胸腺中分化和成熟，是一組具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞群[1]。通過(guò)細(xì)胞接觸依賴(lài)機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子依賴(lài)機(jī)制，主動(dòng)抑制自身免疫性T淋巴細(xì)胞的活化，維持自身免疫耐受，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。王朋等[5]發(fā)現(xiàn)AS患者Treg細(xì)胞上調(diào)，Crispin等[6]研究結(jié)果恰好與之相反。本研究結(jié)果顯示，AS患者外周血Treg細(xì)胞低于健康對(duì)照組，與Crispin等的結(jié)論相符。

注：a為淋巴細(xì)胞收集圖，b為CD3+CD8-的細(xì)胞，c為CD3+CD8-CD69-細(xì)胞，d為CD3+CD8-CD69+細(xì)胞圖1　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD8-CD69+細(xì)胞(CD69細(xì)胞)設(shè)門(mén)分析方法Fig.1　determination of CD3+CD8-CD69+cells (CD69cells) with flow cytometry

注：a為正常對(duì)照，b為低活動(dòng)性AS，c為高活動(dòng)性AS圖2　Th17和Treg細(xì)胞百分率(流式細(xì)胞術(shù))Fig.2　The percentage ofTh17and Treg cells

Th17細(xì)胞具有分化白細(xì)胞介素(interleukin，IL)23依賴(lài)性，產(chǎn)生IL-17，而不產(chǎn)生γ-干擾素為特征的T細(xì)胞亞群，通過(guò)分泌促炎細(xì)胞因子IL-17，確保中性粒細(xì)胞分化、成熟和活化，刺激單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活化來(lái)參與AS炎癥反應(yīng)[7]。本研究中AS患者外周血Th17細(xì)胞與AS活動(dòng)性呈正相關(guān)(P<0.01),但低活動(dòng)性AS組外周血Th17細(xì)胞增高并不明顯，高活動(dòng)性AS組外周血Th17細(xì)胞明顯增高，提示Th17細(xì)胞主要介導(dǎo)AS活動(dòng)期的炎癥反應(yīng)，并參與疾病的進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)Th17/Treg失衡與Th17數(shù)量增加優(yōu)勢(shì)及Treg細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)，與LangrishCL等結(jié)論一致[1]。進(jìn)一步研究顯示，外周血Treg細(xì)胞的這種減低在AS低活動(dòng)性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在AS高活動(dòng)性組存在顯著差異，提示AS疾病早期Treg細(xì)胞仍能正常行使反饋功能，抑制炎性反應(yīng)，隨疾病活動(dòng)性增強(qiáng)優(yōu)勢(shì)促炎細(xì)胞因子的作用下，如IL-6，刺激了Thl7細(xì)胞分化，抑制了Treg細(xì)胞的分化[8]。本研究中，AS患者Treg細(xì)胞與AS活動(dòng)性呈負(fù)相關(guān)，檢測(cè)AS患者外周血Treg細(xì)胞可作為判斷AS疾病活動(dòng)性的參考指標(biāo)。但單獨(dú)比較Th17細(xì)胞或Treg細(xì)胞與疾病活動(dòng)性的相關(guān)性不及Th17/Treg細(xì)胞比率，聯(lián)合檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞，比較Th17/Treg細(xì)胞的失衡對(duì)研究AS疾病活動(dòng)監(jiān)測(cè)意義更大。

Th17、Treg細(xì)胞在人體復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)中起到重要作用，糾正細(xì)胞失衡、調(diào)節(jié)其功能是治療AS的可能策略，能達(dá)到誘導(dǎo)病情緩解、減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用[9]。Th細(xì)胞功能失衡進(jìn)而導(dǎo)致AS的發(fā)生、發(fā)展，故可通過(guò)檢測(cè)Th17、Treg、細(xì)胞及Th17/Treg比例，監(jiān)測(cè)AS患者的治療及疾病活動(dòng)情況。

綜上所述，AS患者存在Th17、Treg細(xì)胞的失衡，隨著AS疾病活動(dòng)度的增高，患者體內(nèi)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)，而Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制作用減弱，聯(lián)合檢測(cè)AS患者外周血Th17、Treg細(xì)胞有助于AS病程監(jiān)測(cè)，對(duì)AS臨床治療有重要意義。因此，Th17、Treg細(xì)胞及Th17/Treg比例有望成為臨床判斷AS病情的有效指標(biāo)，可能為AS診療提供新思路。

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(2014-09-29收稿，2014-11-03修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

·臨床研究·

A Study on the Clinical Value and Correlation of Treg and Th17

Cells among Different Active Stages of Ankylosing Spondylitis

WANG Zuolong1， ZHONG Naifeng2， MA Li1

(1.CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Department

ofBiotechnology,SchoolofMedicalBioengineeringofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the clinical significance and correlation of T helper cells 17(Th17) and regulatory T cells(Treg) in different stages of patients with ankylosing spondylitis(AS) . Methods: A total of 78 peripheral blood samples were taken from AS patients，the AS group was divided into low-activity AS group and high-activity AS group, 30 healthy peripheral blood samples serves as control group. Th17 and Treg numbers were detected by flow cytometry(FCM ) and intracellular cytokine staining technique(ICS) to study the relationship between Treg, Th17 cells and AS activity. Results: Compared with the control group, the percentage of Treg cells in AS group and low-activity AS group had no significant difference (P>0.05), high-activity AS group peripheral blood Treg cells were significantly reduced(P<0.01).The percentage of Th17 cells in AS group increased(P<0.01), peripheral blood Th17 percentage of low-activity AS group and high-activity AS group were increased(P<0.05), and the ratios of Th17/Treg in AS group , low-activity AS group and high-activity AS group were increased(P<0.01).The ratio of Treg cells of high-activity AS group was significantly lower than that of low-activity AS group(P<0.01); the ratio of Th17 cell of high-activity AS group was significantly higher than that of low-activity AS group(P<0.01); the ratio of peripheral blood Th17/Treg cell of high-activity AS group was significantly higher than that of low-activity AS group(P<0.01). There were positive correlation of Bath ankylosing spondylitis disease activity index (BASDI) with peripheral blood Th17 cell ratio and Th17/Treg ratio of AS patients, negative correlation between BASDI and Treg cells ratio of AS patients(P<0.05). Conclusions: Changes of the amount of Treg and Th17 cells is related to the occurrence and development of AS. The amount of Treg and Th17 and the ratio of Th17/Treg can contribute to diagnose AS patient condition and serve as the treatment target of AS.

[Key words]T helper cells 17； regulatory T cells； spondylitis， ankylosing; immunity,cellular; autoimmune diseases

[中圖分類(lèi)號(hào)]R446.62

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)01-0068-04

通信作者**E-mail:18608505639@163.com網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-01-13

[基金項(xiàng)目]*貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合LG字(2011)034號(hào)]