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人臍帶間充質(zhì)干細胞致瘤性試驗*

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20141205.1507.002.html

許鍵煒1,2， 何志旭1,3**， 舒莉萍1,4， 王鳳昌1

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州 貴陽550004； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004； 3.貴陽醫(yī)學(xué)院附院 兒科， 貴州 貴陽550004； 4.貴陽醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞對裸鼠的致瘤性。方法： 培養(yǎng)擴增人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞，制備成細胞生理鹽水混懸液注射裸鼠。觀察8周裸鼠體內(nèi)有無腫瘤生長。結(jié)果： 裸鼠注射細胞后無明顯不適，8周觀察期內(nèi)裸鼠體內(nèi)未見腫瘤生長，病理組織學(xué)檢測未見異常。結(jié)論： 人臍帶間充質(zhì)干細胞導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的可能性低。

[關(guān)鍵詞]臍帶； 間充質(zhì)干細胞； 細胞，培養(yǎng)的； 小鼠,裸； 免疫組織化學(xué)； 致癌性試驗

近年來，干細胞技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用。利用干細胞修復(fù)受損組織可重建其功能，在肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、腦癱、脊髓損傷、骨折不愈合、視網(wǎng)膜色素變性等諸多疾病的治療中療效良好[1]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最初發(fā)現(xiàn)存在于骨髓中，目前已能從臍帶、臍血和羊水中分離和制備[2]。MSCs具有免疫調(diào)控、造血支持、連續(xù)傳代和凍存后仍有自我復(fù)制和多向分化潛能等特點，在特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為多種組織細胞，可作為種子細胞用于組織器官損傷修復(fù)和抗衰老[3]。臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)因其增殖能力強、取材方便，在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和組織工程中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[3]。但有關(guān)干細胞的安全性存在一定爭議，有學(xué)者認為腫瘤源自干細胞[4]。因此，作為種子細胞的MSCs的安全性是臨床前研究必須明確的基本問題。裸鼠由于其先天胸腺缺失，T、B淋巴細胞功能和胸腺依賴免疫功能完全缺乏，是致瘤實驗的理想動物[5]。本試驗旨在通過HUCMSCs對裸鼠的致瘤性試驗，為臨床使用HUCMSCs提供參考。

1材料與方法

1.1材料

新生兒臍帶(貴陽仁愛醫(yī)院婦產(chǎn)科提供)，胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司),無血清培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，L-DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，流式檢測試劑盒(PE、APC、FITC、Cy5.5，美國BD公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)，倒置相差顯微鏡(日本PANASONIC公司)，流式細胞儀(MOFLO ，美國貝克曼庫爾特公司)。Balb/c裸鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK、2009-0004)。

1.2方法

1.2.1HUCMSCs培養(yǎng)及鑒定無菌操作下采集符合條件(產(chǎn)婦年齡20~35歲，健康，無各種遺傳、傳染性疾??；胎兒足月，健康，體重超過2.5 kg)新生兒的10~15 cm長臍帶一條，去除臍帶動靜脈血管和外膜層，取華爾通膠，剪刀剪碎成1 mm×1 mm×1 mm，平鋪接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，加入含10% FBS的L-DMEM液10 mL，培養(yǎng)箱5% CO2，37 ℃飽和濕度培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察，5 d后半換液，以后每4~5 d全換液，待細胞融合達50%以上去除華爾通膠，繼續(xù)培養(yǎng)。細胞融合至80%~90%傳第1代，之后加用含有生長因子的無血清培養(yǎng)基。傳至第4代，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞膜表面分子CD90、CD44、CD105、CD73的表達。

1.2.2實驗分組及觀察參照《中華人民共和國藥典》三部 (2010版)標準[6]，取8周齡，體重18~20 g的雌性Balb/c裸鼠10只。按隨機數(shù)字表法分為對照組和實驗組，每組5只。動物在具有獨立通氣籠盒( IVC) 的SPF級屏障系統(tǒng)條件下飼養(yǎng)。室溫控制在26~28 ℃，相對濕度保持在40%~60%。標準飼養(yǎng)盒內(nèi)喂養(yǎng)，每盒2~3只，每日照明12 h。 實驗組裸鼠于單側(cè)前、后腿內(nèi)側(cè)皮下分別接種培養(yǎng)至第4代的含HUCMSCs 1×109/L的細胞懸液0.5 mL。對照組同一部位注射等量生理鹽水。觀察裸鼠8周內(nèi)有無瘤體生長及其他不良反應(yīng)發(fā)生；于注射后第8周末處死裸鼠，并行常規(guī)組織病理學(xué)檢查。

2結(jié)果

2.1HUCMSCs的培養(yǎng)、鑒定及收集

2.1.1細胞培養(yǎng)接種約1周可見細胞貼壁生長。接種2周左右細胞融合達50%，呈梭形、流水樣生長分布；培養(yǎng)3周左右，細胞融合達80%~90%。加用含有生長因子的無血清培養(yǎng)基后，生長迅速。1傳2，3~5 d可傳下一代。見圖1。

圖1　培養(yǎng)至第4代的人臍帶間充質(zhì)干細胞(40×)Fig.1　HUCMSCs cultured to the fourth generation

2.1.2流式細胞鑒定流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第4代的細胞，流式檢測顯示CD105+、CD90+、CD73+、CD44+，NOT-HUCMSCs-。見圖2。

圖2　HUCMSCs免疫表型Fig.2　The immunophenotype of HUCMSCs

2.1.3HUCMSCs收集細胞使用前棄培養(yǎng)液，生理鹽水洗滌兩遍后加入0.25%胰蛋白酶2 mL，置37 ℃培養(yǎng)箱消化3 min，等量L-DMEM液終止消化。吸管吹打使貼壁細胞游離，后收集入離心管800 r/min離心，生理鹽水洗滌兩遍重懸成細胞懸液備用。臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)達90%以上。

2.2裸鼠注射HUCMSCs后觀察

8周觀察期內(nèi)裸鼠未見明顯不良反應(yīng)，無死亡。注射HUCMSCs懸液第8周末，經(jīng)處死解剖未見瘤體形成。病理檢查示正常組織結(jié)構(gòu)，未見有集落形成及特殊病變。 見圖3。

圖3　裸鼠注射HUCMSCs部位病理學(xué)結(jié)果(HE，×40)Fig.3　Histopathologic findings on HUCMSCs injection site of nude mice

3討論

MSCs具有分化形成多種成熟細胞的能力，特別是其跨胚層、跨系統(tǒng)的分化潛能，對多系統(tǒng)疾病的治療、器官的重建以及損傷的修復(fù)有著重大的影響。HUCMSCs作為一類免疫缺陷細胞，異體移植免疫排斥反應(yīng)弱，不同個體之間的移植，不需配型即可使用[9-10]。MSCs獨特的生物學(xué)特征在再生醫(yī)學(xué)中展現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景，成為了研究的熱點。 裸鼠具有免疫缺陷特點，異種移植時不產(chǎn)生排斥反應(yīng)[5]，在裸鼠皮下接種已知可致瘤(或癌) 性細胞可生長成具有原發(fā)瘤組織形態(tài)、染色體組型及免疫特點的實體瘤[11-12]。因此，在藥品、生物制品的安全性評價領(lǐng)域以及免疫、腫瘤研究中占據(jù)愈來愈重要的地位。

胚胎干細胞移植可形成多種畸胎瘤已被學(xué)界公認，Houghton等[13]報道骨髓源性干細胞移植可導(dǎo)致胃癌，Matsubara等[14]認為干細胞導(dǎo)致的新生血管可能形成血管瘤。本試驗通過機械法分離、培養(yǎng)、擴增可獲得大量HUCMSCs，將傳至第4代的HUCMSCs進行流式細胞儀檢測顯示CD105+、CD90+、CD73+、CD44+，NOT-HUCMSCs-，符合MSCs的生物學(xué)特征[7-8]。將HUCMSCs移植在Balb/c免疫缺陷裸鼠皮下，細胞用量按公斤體重計，為臨床通常用量的500倍。增加干細胞的移植數(shù)量，就會加大致瘤的風(fēng)險[15]。但經(jīng)8周后解剖學(xué)及病理組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常。通過其對裸鼠的致瘤性研究，結(jié)果初步表明，經(jīng)過短期傳代培養(yǎng)的HUCMSCs不具有致瘤性，這與文獻[16]報道相符。HUCMSCs容易獲得，采集對產(chǎn)婦和新生兒均不會帶來任何創(chuàng)傷和不良反應(yīng)，且病原微生物感染及傳播幾率相對較低，亦不涉及法律和倫理方面的爭議，是組織工程理想的種子細胞，實驗結(jié)果初步表明其傳代早期的細胞應(yīng)用于臨床是安全的。目前其臨床應(yīng)用尚處于起步階段，有關(guān)HUCMSCs移植的適應(yīng)癥、 禁忌癥、 并發(fā)癥、 遠期療效和遠期的安全性等問題仍需大量長期的實驗及臨床觀察。

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(2014-10-10收稿，2014-11-25修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙毅

Tumorigenicity Test of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

XU Jianwei1,2， HE Zhixu1,3， SHU Liping1,4， WANG Fengchang1

(1.TissueEngineeringandStemCellResearchCenter,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China;

2.DepartmentofPharmacology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.Department

ofPediatrics,AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China;

4.DepartmentofImmunology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate nude mice's tumorigenicity caused by human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSCs). Methods: Cultured and amplified HUCMSCs，and prepared into cell normal saline hypodermic injection used for injecting nude mice. Tumor growth condition was observed for eight weeks. Results: Mice had no obvious adverse reaction，8 weeks of tumorigenicity study showed that no tumor developed．Histopathologic examinations also showed no abnormality. Conclusions: The possibility of HUCMSCs lead to tumor growth is very low.

[Key words]umbilical cord; mesenchymal stem cells； cell, cultivated; mice, nude; immunohistochemistry; tumorigenicity test

[中圖分類號]R73-35

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)01-0017-03

通信作者**E-mail:hzx@gmc.edu.cn網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-11-27

[基金項目]*國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30560159)；貴州省“125計劃”重大科技專項[黔教合重大專項字(2013020) ]；貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目[黔教合KY字(2012036)]