蔣會(huì)慧

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室　亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

王園園

(亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

胡東華

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

江榮炎

(亳州市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 亳州 236800)

三七總皂苷對(duì)大鼠大腦缺血再灌注VEGF表達(dá)的影響

蔣會(huì)慧

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

王園園

(亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800)

胡東華

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

江榮炎

(亳州市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 亳州 236800)

[摘要]目的:觀察三七總皂苷(PNS)對(duì)預(yù)處理大鼠大腦缺血再灌注后血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子( VEGF)表達(dá)的影響。方法:將48只SD大鼠隨機(jī)平均分為假手術(shù)組、模型組、PNS組和尼莫地平對(duì)照組。預(yù)給大鼠PNS 7d后，制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。觀察各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及大腦TTC染色，從VEGF的角度檢測(cè)免疫組化和mRNA水平表達(dá)情況。結(jié)果: PNS可以顯著改善大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和降低腦梗死體積，并可增加VEGF蛋白表達(dá)和上調(diào)VEGF mRNA表達(dá)水平。結(jié)論:PNS能有效上調(diào)腦缺血再灌注損傷后VEGF mRNA濃度的表達(dá)，促進(jìn)缺血區(qū)血管新生。

[關(guān)鍵詞]三七總皂苷(PNS); 腦缺血; 再灌注損傷；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子( VEGF)

缺血性腦血管病(Ischemic Cerebral Vascular Disease，ICVD)是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的心腦血管疾病，占腦血管病的60%～80%。隨著當(dāng)今社會(huì)的老齡化，其發(fā)病率在不斷增高，如何有效的降低死亡率和致殘率是治療該類(lèi)疾病的核心問(wèn)題。三七總皂苷(Panax notoginseng saponin, PNS) 是五加科植物三七的主要活性成分，也是臨床治療心腦血管病藥物血栓通注射液的主要成份。PNS中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Rg1、Rd和Re約占總皂苷含量的80%[1]，具有防止脂質(zhì)沉積、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、促纖溶及抑制血小板聚集、促進(jìn)微循環(huán)、抗動(dòng)脈粥樣硬化和保護(hù)心肌等作用[2,3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子( VEGF) 又稱(chēng)血管通透性因子( VPF) ，可特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞， 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的新生，并增加其通透性。本實(shí)驗(yàn)以腦缺血再灌注損傷中VEGF mRNA表達(dá)水平為切入點(diǎn)，在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion ,MCAO)再灌注模型上觀察PNS對(duì)VEGF表達(dá)的影響，旨在探討PNS在缺血性腦血管病治療與恢復(fù)中的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠，SPF級(jí)，質(zhì)量180～220g，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK( 皖) 2005-001)。動(dòng)物常規(guī)喂養(yǎng)，自由飲水；飼養(yǎng)室光10h，黑暗14h，溫度21～25 ℃，濕度30%～70%。

1.2藥物和主要試劑

PNS，麗珠集團(tuán)利民制藥廠(批號(hào)：ZZ-5802， 粵衛(wèi)藥準(zhǔn)字( 1994) 第801313號(hào))，使用時(shí)用生理鹽水配成質(zhì)量濃度為2.5g/L。陽(yáng)性對(duì)照藥尼莫地平注射液(浙江一新制藥股份有限公司，批號(hào)：01092001，規(guī)格20mg/100mL )，使用時(shí)用生理鹽水配成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL[4]。紅四氮唑( 2, 3, 5-Triph-enyltetrazoliumchloride，TTC，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)20010201) ；RNApure 超純總RNA快速提取試劑盒(博邁德生物)；VEGF抗大鼠一抗購(gòu)自Santa Crutz公司；Trans Script TM One-Step RT-PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；兔SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉生物制劑公司；Fast SYBR@Green Master Mix (Applied Biosystems)；其他試劑均為市售分析純。

1.3分組與給藥

雄性大鼠48只按體重隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型組、PNS組和尼莫地平對(duì)照組(每組12只)。各組大鼠預(yù)給藥7d，1次/d，PNS給藥劑量為2.5g/L，尼莫地平注射液給藥劑量為0.1mg/mL，均為臨床等效劑量[4]；以同等體積的生理鹽水給予假手術(shù)組和模型組。

1.4模型建立及標(biāo)本采集

參照Longa等[5]的線栓改良法制備大鼠左側(cè)大腦MCAO局灶性腦缺血模型。采用10% 水合氯醛 ( 350mg/kg，ip) 麻醉大鼠，制備腦缺血再灌注模型；缺血2h后再灌注24h，仰臥位固定大鼠，將線栓輕輕外抽，實(shí)現(xiàn)再灌注，剪斷線栓。剔除死亡及不符合標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物，蘇醒后行走向左旋轉(zhuǎn)或左側(cè)肢體癱瘓的大鼠為栓堵或者再灌注成功。假手術(shù)組僅分離血管。大鼠于造模成功后，斷頭處死，取腦組織，按檢測(cè)指標(biāo)要求的不同貯存于甲醛或液氮中。

1.5觀察指標(biāo)

1)神經(jīng)行為評(píng)分(NBS)。采用Longa評(píng)分法[5]。 0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：輕度局造性神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展左側(cè)前肢)；2分：中度神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)轉(zhuǎn)圈)；3分：重度神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)傾倒)；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。

2)TTC染色，觀察腦梗死體積。腦缺血再灌注24h后，將大鼠斷頭取大腦，將完整的大腦置于盛生理鹽水的培養(yǎng)皿，沿冠面均勻切成厚約2mm的五片腦組織，迅速移至用生理鹽水配制的2% TTC液體，避光染色，37℃孵育0.5h。搖動(dòng)培養(yǎng)皿以充分反應(yīng)，腦片中正常組織被染成紅色，梗死組織呈白色，30min后將腦組織從孵育的培養(yǎng)皿中拿出，置于4%多聚甲醛溶液中，換液兩次，4℃冰箱固定24h，用相機(jī)拍下記錄[6]。

3)免疫組化測(cè)定。每組取3只做免疫組化鑒定，用免疫組化染色(ABC法)[7]，組織薄片以PBS(0.01mol/L)漂洗2次, 0.3%過(guò)氧化氫孵育10min; PBS漂洗3次, 正常山羊血清37℃孵育15min后, 滴加稀釋后的一抗(VEGF為：1∶200)稀釋倍數(shù)。陰性對(duì)照以0.01mol/LPBS代替1抗。光學(xué)顯微鏡觀察免疫組化染色結(jié)果，組織片中細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色者為免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。

4)Real Time PCR測(cè)定VEGF mRNA水平。每組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取3只大鼠斷頭取大腦，液氮速凍后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ〕瞿X組織適量，提取總RNA，電泳分析表明A260/A280比值在1.7～2.0之間，總RNA片段完整未降解，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。取2μg RNA，按照TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42℃ 30min；85℃ 5 min。然后用ABI StepOne PlusTMReal Time PCR進(jìn)行PCR反應(yīng)，取2.0μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，加入上下游引物20μmol/L各0.5μL，F(xiàn)ast SYBR@Green Master Mix 10μL，補(bǔ)充Rase-free water至20μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 20s預(yù)變性，95℃ 3S變性，60℃ 30s退火，共40個(gè)循環(huán)。每次擴(kuò)增設(shè)置β-actin 作為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量分析，用2-(△△Ct)方法分析。特異性引物序列見(jiàn)表1。

表1　Real Time PCR用的特異性引物序列

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用板栗花富含黃酮類(lèi)化合物的特點(diǎn)，以及黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化作用，通過(guò)提取、分離精制，生產(chǎn)黃酮含量高的制劑，進(jìn)而與其他食品或助劑配伍，開(kāi)發(fā)板栗花保健食品；利用黃酮、多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)皮膚的美白等保健功能，可以開(kāi)發(fā)板栗花美白化妝品，如乳液、膏霜、水劑、面膜等；通過(guò)板栗花抑菌能力追蹤研究，提取或分離出抗抑菌能力強(qiáng)的成分或成分組合，開(kāi)發(fā)板栗花天然抗菌藥品，減少人們對(duì)抗生素的依賴(lài)。

2結(jié)果

2.1大鼠Longa評(píng)分

假手術(shù)組﹑模型組﹑PNS組和尼莫地平組的Longa評(píng)分分別為0﹑(3.0±0.73)﹑(0.79±0.62)﹑(0.65±0.76)分。除假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)行為缺損癥狀外，其他各組大鼠則顯示出不同程度的神經(jīng)行為缺損癥狀。與假手術(shù)組相比，模型組的神經(jīng)缺損評(píng)分表現(xiàn)較高，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比， PNS組和尼莫地平組的神經(jīng)缺損評(píng)分表現(xiàn)都有所降低P<0.05。

2.2大鼠腦組織TTC染色

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠大腦有明顯的腦梗死面積。與模型組比較， PNS組和尼莫地平組的大鼠大腦腦梗死面積不明顯。

2.3VEGF免疫組化結(jié)果

如圖1所示，假手術(shù)組大鼠的皮質(zhì)、海馬和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)中VEGF蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組的缺血半暗區(qū)有較多的神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白。和模型組比較，模型+PNS組和模型+尼莫地平組的VEGF蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組VEGF免疫組化結(jié)果(ABC，×400)

圖2　PNS對(duì)大鼠大腦缺血再灌注VEGF mRNA水平表達(dá)的影響

如圖2所示，相較于假手術(shù)組，模型組大鼠大腦VEGF的 mRNA表達(dá)水平升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相較于模型組， PNS組和尼莫地平組的大鼠大腦VEGF的 mRNA表達(dá)水平升高明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

3討論

VEGF是促進(jìn)血管增生的重要因子，其生物學(xué)功能及在腦梗塞治療中的重要作用已逐漸被人們關(guān)注。VEGF 可促使微血管通透性增加，有助于促進(jìn)在完全阻塞血栓中產(chǎn)生再通血管，促進(jìn)周?chē)鷤?cè)枝循環(huán)建立和改善內(nèi)皮細(xì)胞依賴(lài)性血管舒張，從而在缺血性腦血管疾病的治療中發(fā)揮重要作用[8]。在正常生理?xiàng)l件下，VEGF mRNA僅在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)且水平甚低，而在缺血性腦血管病如腦梗塞時(shí)，梗死灶及缺血半暗帶中VEGF mRNA表達(dá)增高[9]。Hayashi 等[10]用免疫組化方法研究了大鼠MCAO后VEGF蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)缺血90min、再灌注1h供血區(qū)皮質(zhì)部分神經(jīng)元胞漿可見(jiàn)VEGF表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)以PNS臨床劑量預(yù)處理大鼠7d，經(jīng)缺血再灌注后觀察各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和大鼠大腦TTC染色，并從VEGF的角度觀察其免疫組化和mRNA水平表達(dá)情況，初步探討PNS預(yù)處理大鼠后，對(duì)缺血再灌住后的生理和對(duì)VEGF的影響。結(jié)果顯示，模型組的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，缺血再灌注模型成功。相較于模型組，PNS組和尼莫地平組的神經(jīng)缺損評(píng)分表現(xiàn)都有所降低，說(shuō)明對(duì)于大鼠大腦的缺血再灌注損傷，PNS可有顯著的改善作用。相較于模型組，PNS組和尼莫地平組的大鼠大腦腦梗死面積并不明顯，說(shuō)明預(yù)給予PNS，可以顯著減輕腦梗死面積。這與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。

從VEGF的角度，免疫組化結(jié)果表明模型組的缺血半暗區(qū)有較多的神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白。相較于模型組，PNS組和尼莫地平組的VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng)較明顯。在mRNA水平，模型組大鼠大腦VEGF的 mRNA表達(dá)水平明顯升高。相較于模型組，PNS組和尼莫地平組的大鼠大腦腦VEGF的 mRNA表達(dá)水平升高明顯。

綜上所述，PNS可以改善大鼠大腦缺血再灌注引起的損傷，并且可以增強(qiáng)VEGF mRNA水平的表達(dá)。故初步推測(cè)三七總皂可能是通過(guò)上調(diào)缺血區(qū)腦組織血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGF mRNA的表達(dá)，促進(jìn)缺血區(qū)新生血管形成，恢復(fù)缺血區(qū)腦組織及神經(jīng)細(xì)胞血流供應(yīng)，而起到治療腦缺血再灌注損傷及減輕恢復(fù)期功能障礙的作用，對(duì)其臨床療效有一定的指導(dǎo)意義。至于PNS究竟通過(guò)何種途徑激活并上調(diào)VEGF mRNA的表達(dá)，其確切機(jī)制尚不十分清楚，還有待日后進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Li X Y, Wang G G, Sun J G, et al. Pharmacokinetic and absolute bioavailability study of total panax notoginsenoside, a typical multiple constituent traditional Chinese medicine (TCM) in rats [J]. Biol Pharm Bull, 2007, 30(5): 847～851.

[2] 李曉宇, 孫建國(guó), 鄭媛婷, 等. PNS對(duì)抗pO2 所致大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2007, 23(8): 1030～1034.

[3] 吳穎, 孫冰, 肖靜, 等. 三七皂苷R1對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(2): 179～184.

[4] 李花, 鄧常清, 陳北陽(yáng), 等. PNS對(duì)大鼠腦缺血再灌注后Caspase表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22(2): 189～193.

[5] Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke, 1989, 20(1): 84~91.

[6] 韓若東, 湯其強(qiáng), 肖晗, 等. 丹參酮 ⅡA對(duì)早期腦缺血和腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(6): 655～658.

[7] 牛建國(guó), 何仲義. 大鼠MCAO再灌注模型的改良及GM1對(duì)大鼠MCAO再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].銀川：寧夏醫(yī)學(xué)院, 2005.

[8] 鄭嬋娟, 廖維靖, 楊萬(wàn)同, 等. 當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2005, 11(12): 973～975.

[9] 崔常香, 孔立紅, 周紅娟, 等. 穴位埋線對(duì)腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)VEGF mRNA表達(dá)的影響[J]. 湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 12(4): 21～23.

[10] Hayashi T, Abe K, Suzuki H, et al. Rapid induction of vascular endothelial growth factor gene expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats [J]. Stroke, 1997, 28: 2039～2044.

[11]王海芳. PNS保護(hù)腦缺血再灌注腦損傷機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 15(2): 73～75.

[編輯]劉陽(yáng)

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1673-1409(2015)12-0001-04

[中圖分類(lèi)號(hào)]R363

[作者簡(jiǎn)介]蔣會(huì)慧(1978-)，女，講師，主要從事血管藥理學(xué)研究工作， bzyhuli@126.com。

[收稿日期]2015-01-05

[引著格式]蔣會(huì)慧,王園園,劉立富,等. 三七總皂苷對(duì)大鼠大腦缺血再灌注VEGF表達(dá)的影響[J]. 長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2015，12(6)：1~4.