建立一種測定毛發(fā)中THC和THCC的LC/MS/MS分析方法

★韓方*(浙江中醫(yī)藥大學杭州 310053)

摘要：目的：建立一種大麻活性成分△9-四氫大麻酚﹙THC﹚及其主要代謝物△9-氘代四氫大麻酚﹙THCC﹚的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-多反應監(jiān)測(LC-MS/MS-MRM)分析方法。方法：毛發(fā)經(jīng)去污處理后，甲醇萃取分離、純化，采用LC-MS/MS法分析，用正負離子切換模式進行THC與THCC的定量分析。結(jié)果：該方法對THC與THCC的線性范圍為1～20 ng/mg﹙r>0.997﹚，檢測限分別為0.5 ng/mg 和0.25 ng/mg，定量限分別為1ng/mg與0.5 ng/mg。日內(nèi)和日間的精密度分別為1.2%～8.8%和1.9%～9.5%，準確度為86.9%～113.1%。結(jié)論：建立的LC-MS/MS分析方法快速、靈敏、準確、可靠，適用于毛發(fā)中大麻活性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的定量測定。

關鍵詞：毛發(fā)；THC；THCC；LC-MS/MS

大麻作為世界上最廣泛濫用的毒品，主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)，具有強烈的成癱性和麻醉性，使人的神經(jīng)由興奮轉(zhuǎn)為抑制。大麻中主要起精神活性作用的是△9-四氫大麻酚(THC)，進入體內(nèi)后，在肝臟和其他組織中代謝成 △9-11-羥基-四氫大麻酚(11-OH-THC)，繼而代謝成△9-四氫大麻酸(THCC)。對已超過尿、血檢測時限或需要判斷是偶爾吸食還是長期濫用毒品的情況，可取毛發(fā)作為檢測樣本[1]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜﹙LC/MS/MS﹚因具有較短的分析時間、較高的檢測感度及較高的選擇性，而被越來越多的用于實驗室常規(guī)分析。從THC與THCC的化學結(jié)構(gòu)推論，THC使用正離子檢測模式應可得到較佳的感度，而THCC具有羧基應適合使用負離子檢測模式[2-3]，本研究目的在于采用正負離子切換模式LC/MS/MS分析方法對THC與THCC同時進行檢測[4]。

1儀器與材料

1.1儀器ACQUITY超高效能液相色譜儀(美國Waters Corporation)，API 2000型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems)，PipetmanUlttra微量吸取器(美國Gilson, Inc.)，SevenEasyS20酸堿值測定儀(瑞士Mettler-Toledo International Inc)。

1.2試藥△9-四氫大麻酚(THC)(美國Cerilliant公司)；△9-氘代四氫大麻酚(THC-D3)(美國Cerilliant公司)；△9-四氫大麻酸(THCC)(美國Cerilliant公司)；△9-氘代四氫大麻酸(THCC-D9)(美國Cerilliant公司)；甲醇、乙腈、乙酸、二氯甲烷、甲酸均為色譜純，其它試劑均為分析純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜和質(zhì)譜條件色譜柱：Chromolith Performance RP-18e﹙3.0 × 100 mm, Merck, Darmstadt，德國﹚，保護柱：Phenomenex Security Guardkit﹙2.0 × 4 mm ×3.5 mm, Phenomenex, Torrance CA，美國﹚，流動相：甲醇-10 mmol/L 乙酸銨﹙pH=4.0﹚﹙9:1﹚，流速：0.4 mL/min，進樣體積：30μL，柱溫：室溫。

離子源：電噴霧電離源(ESI)，正離子模式：選擇多反應檢測掃描(MRM)模式，噴霧電壓5500V；干燥氣溫度450℃，干燥氣體流量10 μL/min；霧化氣(gas 1)20Psi；輔助氣(gas 2)50psi；簾氣(CUR)30psi；碰撞氣壓力為2；去簇電壓(DP)25V；碰撞能量(CE)均為30 eV；用于定量分析的離子反應分別為m/z 315.2→m/z 193.2(THC)和m/z 318.2→m/z 196.2(THC-D3)。負離子模式：選擇多反應檢測掃描(MRM)模式，噴霧電壓-4500V，去簇電壓(DP)-45V；碰撞能量(CE)為-26 eV；用于定量分析的離子反應分別為m/z 343.2→m/z 299.1(THCC)和m/z 352.0→m/z 308.1(THCC-D9)，其它條件同正離子模式。

2.2溶液制備對照品溶液的制備：分別取100μg/mL的THC和THCC溶液各1.0ml置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，精密量取上述溶液1.0mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

內(nèi)標溶液的制備：分別取100μg/mL的THC-D3與THCC-D9溶液1.0mL置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，精密量取上述溶液1.0mL置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.3分析方法的驗證

2.3.1專屬性取空白毛發(fā)樣品，置于玻璃樣品瓶中，用二氯甲烷震蕩洗滌2次，40℃烘干后剪成約0.2cm的碎段，置于冷凍粉碎機內(nèi)粉碎，精密稱取粉碎后的頭發(fā)樣品粉末20mg，置于玻璃樣品管中，精密量取1mL甲醇至樣品管中，于40℃下超聲震蕩3h，用1mL 塑料針筒取出甲醇萃取液，過0.45μm鐵氟龍針頭濾膜，制得空白毛發(fā)溶液。同法，加入100μL 內(nèi)標溶液和100μL對照溶液，加入甲醇至總體積1mL，經(jīng)3h超聲震蕩萃取，過濾，制成含THC，THC-D3，THCC和THCC-D9的空白毛發(fā)溶液，檢測結(jié)果表明空白毛發(fā)中的基質(zhì)對THC、THCC及其內(nèi)標的檢測無干擾，如圖1和圖2所示，表明該方法的專屬性良好。

圖1　空白毛發(fā)溶液

2.3.2線性關系分別稱取20 mg的空白毛發(fā)粉末置于樣品瓶中，加入含THC和THCC均為1μg/mL的甲醇溶液20、40、50、100、200及400μL，再加入1μg/mL的THC-D3與THCC-D9甲醇溶液100μL，最后加入甲醇至總體積1 mL，經(jīng)3h超聲震蕩萃取，過濾，制成含THC和THCC濃度均為1、2、2.5、5、10及20 ng/mg的毛發(fā)樣品。以LC/MS/MS進行測定，計算測得結(jié)果中各分析物峰面積與內(nèi)標峰面積之比值，并與配制濃度以1/x 權(quán)重方式建立工作曲線。THC及THCC回歸方程,見表1。

圖2　加入THC，THC-D3，THCC和THCC-D9的空白毛發(fā)溶液

藥品名稱線性范圍(ng·mg-1)線性方程rTHC1～20y=0.155x+0.03540r=0.9970THCC1～20y=0.236x+0.00885r=0.9999

2.3.3準確度與精確度取空白毛發(fā)樣品溶液，經(jīng)重復試驗后，計算各測量濃度平均值、標準偏差及相對標準偏差，評估日內(nèi)﹙intra-day﹚或日間﹙inter-day﹚準確度與精密度。

THC與THCC日內(nèi)準確度為88.8%～113.1%；而日內(nèi)精密度以相對標準偏差表示為1.2%～8.8%，如表2所示。

表2　THC與THCC毛發(fā)檢驗方法的日內(nèi)準確度與精密度

THC與THCC日間準確度為86.9%至101.5%；而日間精密度以相對標準偏差表示為1.9%至9.5%，如表3所示。

表3　THC與THCC毛發(fā)檢驗方法的日間準確度與精密度

2.3.4檢測限以信噪比S/N≥3：1計，測得THC與THCC的LOD分別為0.5 ng/mg與0.25 ng/mg。

2.3.5定量限以信噪比S/N≥10：1計，測得THC與THCC的LOQ分別為1ng/mg與0.5 ng/mg。

3討論

本研究建立的毛發(fā)中THC與THCC檢驗方法成功將正負離子切換模式應用于分析方法的中，并通過對色譜條件進行優(yōu)化，使此檢驗方法可在5 min內(nèi)同時完成檢測THC與THCC的含量。

因毛發(fā)中并沒有可以將藥物代謝的酶，所以進入毛發(fā)的藥物在未修剪頭發(fā)的情況下，可穩(wěn)定地保存服用藥物的歷程。在法醫(yī)科學的領域中，毛發(fā)的檢驗常用于證明習慣性的藥物濫用或其藥物濫用的歷史[5]。因為毛發(fā)暴露于吸食大麻時產(chǎn)生的煙霧中，也可能會導致毛發(fā)檢驗檢出的THC為陽性，為了避免偽陽性檢驗結(jié)果的發(fā)生，有必要同時開發(fā)毛發(fā)中THCC準確可靠的分析方法。毛發(fā)檢驗一般可檢驗出一星期至幾個月間之用藥情況，本方法彌補了目前大麻濫用檢測的常用方法尿液、血液檢驗的不足?？梢院芎脤ο率鰞煞N的鑒定：1. 已超過尿、血檢測時限；2.需要判斷是偶爾吸食還是長期濫用毒品。本研究建立的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，經(jīng)實驗證明快速、靈敏、準確、可靠地檢驗人體毛發(fā)中THC與THCC含量，可有效避免假陽性結(jié)果。

參考文獻

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A Method for Simultaneous Determination of THC and THCC in Human Hair by LC/MS/MS

HAN Fang

ZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310053,China.

Abstract:Objective: A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) method in multiple reaction monitoring (MRM) mode was developed and validated for the simultaneous determination of △9-tetrahydrocannabinol (THC) and 11-nor-9-carboxy-△9-tetrahydrocannabinol (THCC) in human hair. Methods: Hair samples after decontamination,was extracted by methylene, purified. LC/MS/MS analysis with polarity switching was then performed to quantitate THC and THCC. Results: The linear range was 1～20 ng/mg (r>0.997).The limit of detection were 0.5 ng/mg and 0.25 ng/mg for THC and THCC. The limit of quantification were 1 ng/mg and 0.5 ng/mg, respectively. The relative standard deviations of intra and inter-day precisions were 1.2%～8.8% and 1.9%～9.5%, respectively. The inter-day accuracy ranged from 86.9%～113.1%. Conclusion: The result showed that the method was rapid, sensitive and accurate, and was applicable in the quantitative determination of THC and THCC in human hair.

Key words:Human Hair;THC;THCC;LC/MS/MS

收稿日期：(2015-06-29)編輯：翟興英

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：B

作者簡介：*韓方(1972—)，男，碩士研究生。研究方向：中藥學。Tel: 13583280360，E-mail: 13583280360@139.com。