*基金項目：國家自然科學基金項目(81260523)；江西省研究生創(chuàng)新基金項目(YC2014-S275) ；江西中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新基金項目(JZYC14A02)。

**第一作者：謝斌，男，副教授，博士，碩士生導師。研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤。

一貫煎單用及與化療聯用對荷H22肝癌小鼠MMP9和NF-κB蛋白表達的影響*

*基金項目：國家自然科學基金項目(81260523)；江西省研究生創(chuàng)新基金項目(YC2014-S275) ；江西中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新基金項目(JZYC14A02)。

**第一作者：謝斌，男，副教授，博士，碩士生導師。研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤。

★謝斌**饒斌余功劉紅寧***(江西中醫(yī)藥大學南昌 330004)

摘要：目的：觀察一貫煎單用及與環(huán)磷酰胺聯用對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-κB表達的影響。方法：雄性昆明小鼠40只，隨機分為模型組、化療組、一貫煎組、一貫化療聯合組。腋下注射H22細胞，建立H22荷瘤模型，一貫煎組造模前兩周開始用藥[劑量為23g mg/(kg·d)]，化療組[劑量為50mg/(kg·d)，隔日1次]，一貫化療聯合組造模后用藥，造模14d后處死小鼠稱重，取瘤組織稱重計算瘤指數，取脾組織稱重計算脾指數，免疫組化檢測MMP9、NF-κB蛋白的表達。結果：化療組、一貫煎組及一貫化療聯合組均具有明顯的抑瘤作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；一貫煎組脾指數增大，與化療組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；一貫化療聯合組能減少MMP9蛋白的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；化療組、一貫煎組、一貫化療聯合組均能減少NF-κB蛋白的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論：一貫煎、環(huán)磷酰胺及其二者聯用均具有抗腫瘤的作用，且均能減少NF-κB蛋白的表達而抑制腫瘤細胞的生長，但只有在二者聯用的情況下才具有降低肝癌組織MMP9蛋白表達的作用，這可能會減少肝癌細胞的轉移。

關鍵詞：一貫煎；環(huán)磷酰胺；肝癌；MMP9；NF-κB

肝癌是外科疾病中的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率和死亡率位居癌癥中第二位，且我國發(fā)病人數居世界首位[1]。中醫(yī)認為肝癌病機為陰虛肝郁，滋陰疏肝經典方劑一貫煎聯合化療在臨床肝癌患者的治療中已被證實有療[2]，但一貫煎單用是否具有抗肝癌作用？其與化療聯合對肝癌的影響是什么？這些問題尚不清楚。本研究擬觀察一貫煎單用及與化療藥環(huán)磷酰胺聯用對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-κB表達的影響，探索其作用機制，為其臨床防治肝癌的應用奠定基礎。

1材料

1.1動物及瘤株 動物：SPF級雄性KM小鼠,體重20±2g,江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(贛)2011-0001。瘤株：小鼠H22肝癌細胞來源：中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫提供。

1.2藥物及制備一貫煎：北沙參10g，麥冬10g，當歸身10g，生地黃30g，枸杞子12g，川楝子5g(購于江西省中醫(yī)院中藥房)。將以上中藥加10倍量的清水浸泡1h，然后煎煮，水沸后以小火煎40min，過濾；第二次加8倍量的清水煎熬，水沸后小火煎40min，過濾，合并濾液，常壓濃縮至67mL(即每毫升藥液含1.15g原藥)，冷卻后密封，4℃保存?zhèn)溆?。實驗藥物濃度?3g/(kg·d)。陽性藥物為環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX，批號13111325)0.2g/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供。CTX藥物濃度為50mg/(kg·d)，隔日1次。

1.3試劑及儀器抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(Dako Denmark A/S，批號20140425)；NF-κBp65一抗(proteintech，批號00017138)；MMP9一抗(proteintech，批號00020746)；二抗HRP標記山羊抗兔(谷歌生物，批號20140415)；BSA(Roche，批號3200687)；倒置顯微鏡(LEICA,DMI3000B)；切片機(上海徠卡儀器有限公司，RM2016)；烘箱(上海?，攲嶒炘O備有限公司，DGX-9003B)；脫色搖床(北京六一儀器廠，WD-9405A)；普通光學顯微鏡(重慶光電儀器有限公司，XSP-C204)。

2方法

2.1肝癌H22細胞接種方法小鼠肝癌H22細胞的培養(yǎng)及傳代：將腹水型小鼠肝癌H22細胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，用含10% FCS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。取最佳生長狀態(tài)的小鼠肝癌H22細胞，濃度調為5×106個/mL，以0.2 mL/只(1×106個細胞/只)無菌注入小鼠腹腔進行接種傳代，于接種7～9d，小鼠腹部膨隆，出現腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接種。

2.2動物模型制作荷H22肝癌小鼠模型的建立[3]：將接種H22瘤種7～9d，腹部隆起明顯的腹水瘤小鼠以脫頸法處死，無菌條件下從腹腔抽出瘤液，以無菌生理鹽水稀釋后，1500 r/min離心5 min，調整瘤細胞濃度為5×106個/mL，于小鼠右腋下行皮下無菌接種，接種量為每只0.2 mL/只。

2.3動物分組造模結束后，小鼠隨機分為模型組、化療組、一貫煎組、一貫化療聯合組，每組10只。

2.4給藥模型組接種24h后，以0.2mL生理鹽水灌胃，每天兩次；化療組接種24h后，CTX以50mg/(kg·d)劑量隔日腹腔注射；一貫煎組造模前兩周即開始按23g/(kg·d)灌胃給藥，每天兩次；一貫化療聯合組接種24h后，一貫煎按23g/(kg·d)灌胃給藥，每天兩次，CTX以50mg/(kg·d)劑量隔日腹腔注射。2w后，處死各組小鼠并稱重，取瘤組織及脾臟稱重。

2.5免疫組織化學法腫瘤組織檢測MMP9、NF-κB蛋白的表達水平組織切片、脫蠟、水化、洗滌、抗原修復、洗滌、滅活酶、洗滌、5% BSA封閉，加入一抗分別為MMP9(1:100)、NF-κB (1:100)，4℃過夜孵育14h；第2d室溫復溫3h后，PBS漂洗3×5 min；加入二抗，4℃孵育50 min；漂洗，DAB顯色；漂洗，蘇木素復染，貼片，脫水和透明，中性樹膠封片。以LEICA倒置顯微鏡拍照，每張標本按順序選5個視野，Image-Pro Plus 6.0分析，用平均光密度(D)表示陽性物質的相對含量。

3結果

3.1一貫煎協同CTX對荷H22肝癌小鼠瘤指數及脾指數的影響結果見表1。

結果表明化療組、一貫煎組及一貫化療聯合組均具有明顯的抑瘤作用，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；一貫煎組脾指數增大，與化療組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.2一貫煎協同CTX對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-κB蛋白表達的影響結果見表2。

結果顯示一貫化療聯合組能減少MMP9蛋白的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；化療組、一貫煎組、一貫化療聯合組均能降低NF-κB蛋白的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1　一貫煎單用及聯合CTX對荷H22肝癌小鼠瘤指數及脾指數的影響±s)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與化療組比較，#P<0.05；實驗過程中，化療組及一貫煎組均有1只小鼠死亡。

表2　一貫煎單用及聯合CTX對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-κB蛋白的表達的影響±s)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；實驗過程中，化療組及一貫煎組均有1只小鼠死亡。

4討論

肝癌是常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居高不降，如何提高肝癌的臨床治療效果是當今醫(yī)學領域迫切需要解決的重大課題之一。中醫(yī)學在肝癌的治療上具有十分重要的地位，中醫(yī)學認為肝癌病機為陰虛肝郁，臨床上的肝癌患者亦多表現為陰虧液涸伴肝氣郁結，故治療應滋陰疏肝。一貫煎是滋陰疏肝名方，方中滋陰養(yǎng)血藥與疏肝理氣藥同用，補肝與疏肝相結合，被譽為涵養(yǎng)肝陰之第一良藥，成為歷代醫(yī)家治療肝病之首崇，且當下亦常有用其于抗肝癌的臨床報道[4-5]。

附圖　一貫煎單用及聯合CTX對荷H22肝癌小鼠MMP9、NF-kB蛋白表達的影響(免疫組化)

式促進腫瘤浸潤及轉移，因此抑制其表達可能會有效地抑制腫瘤的侵襲和轉移[10]。NF-κB是近年來研究發(fā)現的導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵誘因之一[11]，能通過對相應基因的轉錄調節(jié)，促進腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[12]，亦可促使腫瘤產生放化療抵抗而影響治療效果。

本研究結果表明化療組、一貫煎組及一貫化療聯合組均具有明顯的抑瘤作用，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；一貫煎組脾指數增大，與化療組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 一貫化療聯合組能減少MMP9蛋白的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；化療組、一貫煎組、一貫化療聯合組均能降低NF-κB蛋白的表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。由此可見，一貫煎、環(huán)磷酰胺及其二者聯用均具有抗腫瘤的作用，且均能減少NF-κB蛋白的表達而抑制腫瘤細胞的生長，但只有在二者聯用的情況下才具有降低肝癌組織MMP9蛋白表達的作用，這可能會減少其肝癌細胞的轉移。

參考文獻

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Effect of Yiguanjian Single and Combined with Cyclophosphamide on MMP9,NF-κB Protein Expression in H22 Tumor-bearing Mice

XIE Bin, RAO Bin, YU Gong, LIU Hong-ning

JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China.

Abstract:Objective:To observe the effect of Yiguanjian single and combined with cyclophosphamide(CTX) on MMP9,NF-κB expression in H22 tumor-bearing mice. Method:40 male Kunming mice were divided into model group, CTX group, Yiguanjian group and the combination group. Animal models of H22 tumor-bearing mice was induced with the axillary injection of H22 cells, Yiguanjian group was started medication with two weeks before[23g/(kg·d)], CTX group[50mg/(kg·2d)] and the combination group started medication after modeling. After 14d modeling, killing the mice and weighing the tumor tissue and splenic tissue, calculation of the tumor and spleen index, testing the expression of MMP9,NF-κB protein on immunohistochemistry assay. Result:The CTX group,Yiguanjian group and the combination group have obvious antitumor effects, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05 or P<0.01);Yiguanjian group Spleen index increased, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05); The combination group have declined significantly on the expression of MMP9, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05); Yiguanjian group, CTX group and the combination group all have declined significantly on the expression of NF-κB, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.01). Conclusion:Yiguanjian, CTX and union all have antitumor effects, all can reduce the expression of NF-κB protein that inhibit the growth of tumor cells,but only in two were combined can reduced the expression of MMP9 protein in hepatocellular carcinoma, this may reduce the metastasis of tumor.

Key words:Yiguanjian; Cyclophosphamide;Liver Cancer;MMP9;NF-κB

收稿日期：(2015-06-01)編輯：翟興英

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：B

通信作者：***劉紅寧，男，教授，博士生導師。研究方向：滋陰抗腫瘤。