胡 昌 宋 明 河南省濟源市畜牧局動物衛(wèi)生監(jiān)督所 459000

1 材料和方法

1.1 材料

（1）試驗菌株。8 株豬大腸桿菌（E.coil）分離自大腸菌感染的豬體，8 株豬鏈球菌株分離自感染的病豬，均來源于河南省內(nèi)豬場，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院傳染病實驗室自行分離保存。

（2）試劑和藥物?？咕暮团Ｈ飧啵ㄉ噭┵徸员本W星生物技術(shù)有限公司，批號20070720；蛋白胨（生化試劑）購自北京奧星生物技術(shù)有限公司，批號20081102；氯化鈉（分析純）購自天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，批號20080924；磷酸氫二鉀（分析純）購自上海恒信化學(xué)試劑有限公司，批號20080602。

（3）儀器。電熱溫恒溫培養(yǎng)箱：HG303-4 南京實驗儀器廠制造；凈化工作臺：SW-CT-1C 蘇凈集團安泰公司生產(chǎn)；手提式不銹鋼蒸汽消毒器：YX280B上海三申醫(yī)療器械有限公司；雙目生物顯微鏡：CX21日本奧林巴斯。

1.2 方法

（1）菌種的復(fù)蘇和純化。將實驗室保存豬源大腸桿菌的甘油菌種劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，豬鏈球菌接種于血平板，37℃培養(yǎng)24 小時，挑取單個菌落，涂片染色鏡檢，觀察細菌的大小和形態(tài)，選取典型菌體進行試驗。

（2）細菌接種量的確定。用普通肉湯培養(yǎng)基將抗菌肽原液倍比稀釋為1／10 倍~1／2560 倍9 個濃度，加入滅菌試管中。兩種細菌每組隨機選取4 株，用生理鹽水將豬源大腸桿菌和豬鏈球菌以鏡檢計數(shù)方式配成1×107cfu·mL、1×106cfu·mL、1×105cfu·mL、1×104cfu·mL4 種濃度的細菌懸液，分別接種于含不同藥物梯度的普通肉湯培養(yǎng)基中。另做不含藥物的培養(yǎng)基，接種菌懸液，作為生長菌的空白對照。于37℃培養(yǎng)24 小時觀察各菌株的生長情況，以未有細菌生長的最小藥物濃度為MIC。

（3）試管稀釋法對最小抑菌濃度（MIC）的確定。取抗菌肽原液0.2mL 以相應(yīng)的普通肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋成1／10 倍、1／20 倍、1／40 倍、1／80 倍、1／160 倍、1／320 倍、1／640 倍、1／1280 倍和1／2560 倍9 個濃度移入小試管，兩種細菌每組隨機選取4 株，用生理鹽水將大腸桿菌和豬鏈球菌菌株分別以鏡檢計數(shù)法方式配成1×105cfu·mL 的菌懸液，分別在不同的藥物梯度試管中加入20mL 菌液，另做不含藥物的培養(yǎng)基接種菌懸液，作為生長菌的空白對照。樣品于37℃培養(yǎng)，36h 觀察細菌生長情況，分別測定菌種的MIC。

2 結(jié)果

2.1 細菌接種量的確定

由表l 看出 ，在相同培養(yǎng)條件下，抗菌肽的最小抑菌濃度隨細菌濃度的增加而不斷提高，在細菌濃度范圍為1×104cfu·mL 和1×l05cfu·mL 之間為規(guī)則上升，之后MIC 的變化不規(guī)則。為了獲得較好的數(shù)值并獲得較一致的試驗結(jié)果，本試驗將菌株接種濃度確定為1×105cfu·mL 進行抑菌試驗。

表1 不同的細菌濃度對抗菌肽最小抑菌濃度的影響

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定

表2 抗菌肽對豬源大腸桿菌和豬鏈球菌最小抑菌濃度的測定結(jié)果

采用普通肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋法，結(jié)果測得抗菌肽對大腸桿菌的最小抑菌濃度和對豬鏈球菌的抑菌作用。抗菌肽對大腸桿菌的MIC 為原液的1／160~1／80 倍之間。抗菌肽對豬鏈球菌的MIC 明顯小于大腸桿菌的MIC 為1／1280~1／640 倍之間，只表明抗菌肽對豬鏈球球菌的體外抑菌效果明顯優(yōu)于大腸桿菌。從表2 看出，抗菌肽對豬源的大腸桿菌和豬鏈球球菌的抑菌作用有較大差異，對大腸桿菌的MIC 較高，為原液的1／160~1／80 倍之間，而對豬鏈球球菌的MIC 較低，為1／1280~1／640 倍之間。

3 討論

3.1 關(guān)于抗菌肽對豬源大腸桿菌和豬鏈球菌最小抑菌濃度(MIC)

培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間相同時，抗菌肽對大腸桿菌和豬鏈球菌的MIC 與接種細菌的濃度和培養(yǎng)時間相關(guān)，試驗時應(yīng)選擇適當菌量，本試驗在預(yù)試驗中通過測定不同細菌濃度對抗菌肽最小抑菌濃度的影響?？咕膶ωi源大腸桿菌和豬鏈球菌的抑制作用有較大的差異，究及原因可能與大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌有關(guān)，兩種細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)有較大的差異，因此對抗菌肽的耐受性不同。

3.2 關(guān)于抗菌肽在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用

不同來源和不同種類的抗菌肽抗菌特征具有相似性，即具有廣譜抗菌活性，同時對腫瘤細胞也有殺傷作用。研究者發(fā)現(xiàn)抗菌肽可促進動物生長，提高動物抗病能力，不易產(chǎn)生耐藥性。此外，結(jié)合基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因動物也是動物養(yǎng)殖的一種新途徑。Yarus 用顯微注射法將牛氣管AMP 基因轉(zhuǎn)入小鼠，轉(zhuǎn)基鼠成功地表達了牛氣管AMP，鼠乳中的牛氣管AMP 對大腸桿菌具有抗菌活性?？梢娍咕霓D(zhuǎn)基因動物具有明顯增強抗病原微生物的能力，這在動物養(yǎng)殖中具有重要的現(xiàn)實意義。同時昆蟲抗菌肽被認為最具有發(fā)展前景的綠色飼料添加劑?？股仫暳咸砑觿┑氖褂脟乐仄茐牧藙游锬c道的微生物平衡，并且容易在動物體內(nèi)殘留，使生態(tài)環(huán)境中的細菌在與動物接觸中產(chǎn)生耐藥性，嚴重影響畜產(chǎn)品的品質(zhì)和人類的健康，進而影響整個生態(tài)環(huán)境。

隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系、抗菌肽作用機制及其基因表達調(diào)控機制認識的不斷深化，應(yīng)用抗菌肽作為飼料添加劑，可克服耐藥菌株的產(chǎn)生，而抗菌肽成分為易吸收的氨基酸，動物通過飼喂添加抗菌肽的飼料，可增加其對疾病的抵抗力，促進生長。因此用基因工程方法生產(chǎn)特異性抗菌肽添加劑，或通過日糧調(diào)控抗菌肽基因的表達，從而達到畜產(chǎn)品無抗生素化，提高我國畜產(chǎn)品的國際競爭力。當然抗菌肽作為飼料添加劑的研究還處于探索階段，要形成成熟的技術(shù)、大規(guī)模的應(yīng)用到動物生產(chǎn)中還有很多問題需要解決。抗菌肽的種類很多，哪些種類作為飼料添加劑效果較好而且又比較經(jīng)濟，不同種類的抗菌肽之間是否有相互作用，也有待于進一步研究。由于抗菌肽的分子小，直接提取天然抗菌肽時，分離提純存在一定的困難，故化學(xué)合成和基因工程法成為獲得抗菌肽的主要手段，但是化學(xué)合成抗菌肽成本很高。通過基因工程在微生物中直接表達抗菌肽基因時，容易被蛋白酶降解，表達產(chǎn)物可能對宿主有害，需要用脂質(zhì)包被或?qū)ζ溥M行化學(xué)修飾來保護，因此還需對它的釋放機制、受體結(jié)合降解活性及其類似物的結(jié)構(gòu)與活性等進行研究。