林 燕，陳玉龍，黃炳俏，朱寧紅，楊佩剛，4，白 亮，翟夢君，劉恩岐，

（1．西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，陜西西安 710061；2．西安交通大學醫(yī)學部心血管中心脂代謝與動脈粥樣硬化研究室，陜西西安 710061；3．西安醫(yī)學院基礎與轉化醫(yī)學研究所，陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室，陜西西安 710021；4．西安交通大學經濟與金融學院，陜西西安 710061；5．湖北省襄陽市口腔醫(yī)院頜面外科，湖北襄陽 441003）

亞硝基化是一氧化氮（nitric oxide，NO）與蛋白質的半胱氨酸巰基發(fā)生氧化還原反應，以共價鍵可逆性結合形成S-NO鍵導致蛋白亞硝基化，最終生成亞硝基硫醇的過程［1-2］。與蛋白質磷酸化一樣，蛋白亞硝基化普遍存在于細胞信號傳導過程中，是一種非常重要的蛋白翻譯后修飾過程［1］。NO主要通過兩條途徑發(fā)揮生物學作用：環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）依賴途徑和cGMP非依賴途徑。近年來，cGMP非依賴途徑是心血管研究的熱點。在該途徑中，NO能夠通過對蛋白的亞硝基化修飾調節(jié)血管多種生物學功能［3］。大蒜素是從大蒜的鱗莖中提取的一種具有揮發(fā)性的硫化物。最近的研究表明，大蒜素具有抗動脈粥樣硬化作用，其機制可能與其上調內皮細胞NO水平有關［4］。然而，NO在大蒜素抗動脈粥樣硬化作用中的具體機制不詳。內皮細胞蛋白的亞硝基化是NO在心血管疾病中發(fā)揮抗炎和抗氧化作用的重要機制之一［3］。大蒜素能否通過上調內皮細胞蛋白亞硝基化水平發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用仍不清楚。本實驗利用高膽固醇飲食喂養(yǎng)apoE-／-小鼠，觀察大蒜素對動脈粥樣硬化進展的影響，并從內皮細胞蛋白亞硝基化的角度初步探討大蒜素的抗動脈粥樣硬化機制，為大蒜素抗動脈粥樣硬化機制的研究提供一種新視角。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 大蒜素購自上海禾豐制藥有限公司；血脂檢測試劑盒為北京中生北控生物科技股份有限公司產品；小鼠血漿氧化低密度脂蛋白（oxidizedlow density lipoprotein，ox-LDL）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）檢測 ELISA試劑盒購自美國RD公司；兔抗小鼠galectin 3多克隆抗體、兔抗小鼠α-actin單克隆抗體和兔抗亞硝基化的半胱氨酸多克隆抗體均購自英國Abcam公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H＋L）及DAB顯色液購自北京中山金橋生物技術有限公司；Ⅰ型膠原酶購自美國Gbico公司；NO及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；M199培養(yǎng)基和胎牛血清均為美國Hyclone公司生產；內皮細胞生長添加物購自美國Scien Cell Research公司；FITC標記的山羊抗兔IgG（H＋L）購自美國Santa Cruz公司；ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司。

1．2 實驗動物與分組 8周齡雄性apoE-／-小鼠30只，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，隨機分為3組：對照組、大蒜素低劑量組（LA組）、大蒜素高劑量組（HA組）。3組動物均給予高膽固醇飲食（含21%脂肪，0．15%膽固醇）喂養(yǎng)12周。LA組每日給予大蒜素9mg／kg，HA組每日給予大蒜素18 mg／kg，均用生理鹽水稀釋后灌胃給藥，對照組每日給予灌胃等體積的生理鹽水［5］。動物自由攝食及飲水，分籠（3或4只／籠）飼養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)環(huán)境。SPF級飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（20±2）℃，相對濕度40%～70%，每日明暗室各12h。每周稱量動物的體重及剩余飼料。本研究的動物實驗由西安交通大學實驗室動物管理委員會依據西安交通大學實驗室動物準則和美國國家健康委員會出版的實驗室動物福利和使用準則（NIH Publication No．85-23，revised 2011）批準實施。

1．3 apoE-／-小鼠血脂、血漿 NO、MDA、ox-LDL以及TNF-α水平的檢測 于實驗開始后0、4、8、12周，采用肝素處理的毛細玻璃管于小鼠尾部采血，每只小鼠采血量為3支毛細玻璃管。實驗結束后，麻醉小鼠，摘眼球最大量采血。每次采血前小鼠禁食最少8h。3 000r／min離心10min，取上清，待測血漿指標。血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白 膽 固 醇 （low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、NO及MDA均按照試劑盒提供的方法進行檢測。血漿ox-LDL和TNF-α水平均采用小鼠ELISA試劑盒檢測。具體步驟均參照說明書操作。

1．4 apoE-／-小鼠主動脈根部斑塊的病理學觀察以及血管蛋白亞硝基化水平的檢測 實驗結束采集血液標本之后，用磷酸鹽緩沖溶液從左心室逆行灌注主動脈后，自心臟至腹主動脈末端左右髂總動脈分叉離斷整個動脈樹。將所有小鼠心臟連帶近心端2～3 mm主動脈切下，制備主動脈根部8μm厚連續(xù)冰凍切片。冰凍切片每間隔8張取1張，進行蘇木精伊紅染色（hematoxylin and eosin，HE）和范吉爾森彈性纖維（elastica van Gieson，EVG）染色，分析大蒜素對小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)及大小的影響；免疫組化染色分析大蒜素對其主動脈根部斑塊中巨噬細胞（macrophage，MΦ）和血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）含 量 的 影響［6］。各標本經組織化學染色后均采集圖像，應用Win ROOF V6．5（Mitani Co．，Ltd．，F(xiàn)ukui，Japan）圖像分析軟件計算斑塊及其組分面積［6］。

免疫熒光分析大蒜素對小鼠主動脈根部蛋白亞硝基化水平的影響。主動脈根部冰凍切片室溫放置30min后，丙酮室溫固定10min，透化液（含1mL／L Trion X-100，30g／L牛血清白蛋白）室溫透化15min，50 mL／L山羊血清室溫封閉30min，兔抗亞硝基化的半胱氨酸多克隆抗體（1∶100）4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG（H＋L）室溫孵育60min，DAPI染核15min后，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，采集圖片［7］。

1．5 人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng)及分組 人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由新鮮的人臍帶用1g／LⅠ型膠原酶消化法分離獲得后，用含有200mL／L胎牛血清、100U／mL青霉素、100mg／mL鏈霉素、40μg／mL肝素鈉以及10g／L內皮細胞生長添加物的M199完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。HUVECs完全融合成典型的“鋪路石”狀時，用胰酶消化液（0．5g／L的胰蛋白酶＋0．2g／L的ED-TANa2）消化并傳代，第3代用于實驗。

待細胞融合度達90%左右時，用含20mL／L胎牛血清的M199培養(yǎng)基饑餓18h后，實驗設正常對照組、安慰劑組［溶解藥物等體積的DMSO＋ox-LDL（50μg／mL）］，低劑量大蒜素組［大蒜素（10μmol／L）＋ox-LDL（50μg／mL）］、高劑量大蒜素組［大蒜素（20μmol／L）＋ox-LDL（50μg／mL）］［8］。分別處理24h后檢測各項指標。

本實驗所用臍帶均由西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院提供，本研究獲得西安交通大學倫理委員會許可。

1．6 檢測HUVECs培養(yǎng)上清液NO及HUVECs蛋白亞硝基化水平 采用硝酸還原酶法檢測上清中NO水平，具體步驟參照說明書操作。細胞爬片經40 g／L多聚甲醛室溫固定后，免疫熒光法標記 HUVECs亞硝基化蛋白（具體步驟同主動脈根部免疫熒光法），甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，采集圖片，利用Image-Pro Plus軟件分析熒光強度［7］。

1．7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18．0統(tǒng)計軟件。采用均數±標準差對計量資料進行描述，對各組數據進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，符合正態(tài)性分布及方差齊性后采用重復測量設計的方差分析、單因素方差分析結合Tukey's test檢驗分別對其進行統(tǒng)計學分析。若不滿足正態(tài)性和方差齊性的條件則采用秩和檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 大蒜素對血脂水平影響 經統(tǒng)計學分析實驗數據均為正態(tài)分布、方差齊，重復測量設計的方差分析顯示，3組實驗動物間飼料消耗和體重變化均無統(tǒng)計學差異；各組小鼠血漿 TC（P＝0．001）、TG（P＝0．001）、LDL-C（P＝0．001）和 HDL-C（P＝0．023）水平的升高具有時間依賴性；與對照組相比，高、低劑量組小鼠血漿TC（P＝0．708）、TG（P＝0．324）和LDL-C（P＝0．763）水平均有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義（圖1）。

2．2 大蒜素對氧化應激和炎癥相關指標的影響 高膽固醇飲食喂養(yǎng)apoE-／-小鼠12周后，經統(tǒng)計學分析各組實驗數據均為正態(tài)分布、方差齊，與對照組相比，大蒜素處理組血漿ox-LDL、MDA和TNF-α均明顯下降（圖2）。LA組和HA組血漿ox-LDL分別下降了27．82% （P＝0．014）、26．39%（P＝0．029）；MDA分別下降了38．86%（P＝0．028）和40．87%（P＝0．029）；TNF-α分別下降了58．92%（P＝0．001）和54．71%（P＝0．002）。LA組和HA組間的血漿ox-LDL、MDA和TNF-α差異均無統(tǒng)計學意義。

圖1 大蒜素對高膽固醇飲食apoE-／-小鼠血脂 TC（A）、TG（B）、LDL-C（C）及HDL-C（D）水平的影響Fig．1 The effects of allicin on the levels of plasma lipids TC（A），TG（B），LDL-C（C）and HDL-C（D）in apoE-／-mice fed with high cholesterol diet

圖2 大蒜素對小鼠血漿ox-LDL（A）、MDA（B）、TNF-α（C）的影響Fig．2 The effects of allicin on ox-LDL （A），MDA （B），TNF-α（C）in mice fed with high cholesterol diet

2．3 大蒜素對動脈粥樣硬化斑塊形成的影響 高膽固醇飲食喂養(yǎng)apoE-／-小鼠12周后，3組小鼠主動脈根部均見斑塊形成，斑塊內見大量泡沫細胞散在分布，并見脂核（圖3A）。EVG染色及免疫組化染色定量結果經檢驗各組數據均為正態(tài)分布、方差齊。與對照組相比，LA組和HA組小鼠主動脈根部斑塊面積顯著減少，分別減少了46．29%（P＝0．003）和39．67%（P＝0．012）（圖3B）；LA組和HA組小鼠主動脈根部斑塊中MΦ及VSMC的含量均明顯減少，MΦ分別減少了31．58%（P＝0．02）和30．12%（P＝0．027），VSMC分別減少了40．18%（P＝0．018）和37．95%（P＝0．026）（圖3B）；但LA組和 HA組間上述指標差異均無統(tǒng)計學意義。

2．4 大蒜素對小鼠血漿NO水平及主動脈根部蛋白亞硝基化水平的影響 高膽固醇飲食喂養(yǎng)apoE-／-小鼠12周后，經統(tǒng)計學分析各組數據均為正態(tài)分布、方差齊，與對照組相比，LA組和HA組小鼠血漿NO水平均顯著升高，分別升高了57．24%（P＝0．044）和69．41%（P＝0．019）（圖4）。與血漿NO水平變化趨勢一致，大蒜素處理后小鼠主動脈根部蛋白亞硝基化水平較對照組明顯升高（圖5）。

2．5 大蒜素對HUVECs產生NO及其蛋白亞硝基化水平的影響 各組HUVECs經不同因素處理24h后，細胞形態(tài)正常。經統(tǒng)計學分析各實驗組細胞上清NO水平及細胞蛋白亞硝基化水平均為正態(tài)分布、方差齊。上清中NO檢測結果顯示，與對照組相比，安慰劑組NO水平顯著減少（P＝0．001），而高低劑量大蒜素處理組NO水平較安慰劑組顯著升高（P均＝0．002）；與上清液中NO水平變化趨勢一致，與對照組相比，安慰劑組HUVECs蛋白亞硝基化水平顯著下降（P＝0．001），而高低劑量大蒜素處理組 HUVECs蛋白亞硝基化水平較安慰劑組顯著升高（均P＝0．002）（圖6）；但兩大蒜素處理組間上清液中NO水平及HUVECs蛋白亞硝基化水平差異均無統(tǒng)計學意義。

圖3 大蒜素對高膽固醇飲食喂養(yǎng)的apoE-／-小鼠主動脈根部斑塊形成的影響Fig．3 Histological analysis of aortic atherosclerosis in apoE-／-mice fed with high cholesterol diet

圖4 大蒜素對小鼠血漿NO水平的影響Fig．4 The effects of allicin on NO in mice fed with high cholesterol diet

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能夠明顯抑制高膽固醇飲食誘導的apoE-／-小鼠動脈粥樣硬化。結果顯示，大蒜素不僅能夠減少主動脈根部斑塊的面積，也能夠抑制斑塊內MΦ和VSMC的含量；大蒜素還能夠顯著減少血漿ox-LDL、MDA和TNF-α水平，同時增加血漿NO及主動脈根部蛋白亞硝基化水平。另外，體外實驗結果顯示，大蒜素能夠恢復由ox-LDL所導致HUVECs產生NO及其蛋白亞硝基化水平的抑制。

圖5 大蒜素對小鼠主動脈根部蛋白亞硝基化水平的影響Fig．5 The effects of allicin on protein S-nitrosylation of the aortic root in the mouse model（×100）

圖6 大蒜素處理對培養(yǎng)HUVECs NO的產生及蛋白亞硝基化水平的影響Fig．6 The effects of allicin on protein S-nitrosylation and NO release in HUVECs（×200）

NO生物利用度的減少是內皮細胞功能紊亂的主要特征性表現(xiàn)，內皮細胞功能紊亂又是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展整個階段中的起始環(huán)節(jié)［9］。近年的研究表明，內皮細胞的蛋白亞硝基化修飾是NO發(fā)揮血管調節(jié)的重要途徑。蛋白亞硝基化是一種體內廣泛存在的翻譯后修飾，能夠影響細胞的代謝過程，從而調控血管功能。迄今為止，被鑒定出的內皮細胞亞硝基化蛋白已達100多種。這些經亞硝基化修飾的蛋白在調控炎癥、細胞凋亡、內皮細胞的滲透性、細胞遷移、細胞生長以及血管僵硬度方面發(fā)揮重要作用［10-15］。體內的NO主要由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）分解L-精氨酸產生。在完整的血管中，大部分NO由內皮細胞的內皮NOS（endothelial NOS，eNOS）產生。本實驗大蒜素處理組小鼠的血漿NO水平及主動脈根部總蛋白亞硝基化水平均明顯升高。這可能與大蒜素提高內皮細胞的eNOS活性有關，并且NO調節(jié)細胞功能主要通過蛋白質半胱氨酸殘基亞硝基化修飾介導［16］。為了研究血管內皮細胞蛋白亞硝基化水平變化，本實驗還觀察了大蒜素對ox-LDL刺激的HUVECs產生NO及蛋白亞硝基化水平的影響。結果發(fā)現(xiàn)，合用大蒜素處理HUVECs后，其NO水平及蛋白亞硝基化水平明顯高于ox-LDL單獨刺激組，而ox-LDL能夠明顯降低內皮細胞產生NO及其蛋白亞硝基化水平。即大蒜素能夠有效改善ox-LDL所引起的內皮細胞產生NO及發(fā)生蛋白亞硝基化水平的下降。

另外，氧化應激和炎癥反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮很重要的作用［17-18］。大蒜素能夠有效清除超氧陰離子和羥自由基，使脂質過氧化水平降低，從而有效地減輕其對血管內皮和VSMC的損傷，減少血小板在損傷部位的粘附和聚集，同時減少炎癥因子的釋放，最終發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化作用［19］。已有研究表明，亞硝基化能夠通過抑制氧化應激和炎癥反應相關蛋白的活性發(fā)揮抗氧化應激和抗炎作用。如，NADPH還原性輔酶Ⅱ氧化酶組成因子p47phox的亞硝基化能夠抑制該酶的活化，從而抑制內皮細胞發(fā)生氧化應激［20-21］；核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）亞基p65的亞硝基化能夠抑制其核轉位［22］，NF-κB亞基p50的亞硝基化能夠抑制其與DNA結合［23］，從而抑制NF-κB的活化，發(fā)揮抗炎作用。本研究結果顯示，大蒜素在促進NO產生的同時，能夠減少血漿ox-LDL、MDA和TNF-α水平。這表明大蒜素具有抗氧化及抗炎作用，其作用機制可能與NO介導的亞硝基化作用有關。然而，大蒜素的作用效果未顯示劑量依賴效應。

綜上所述，大蒜素具有顯著的抗動脈粥樣硬化作用，與其通過上調內皮細胞蛋白亞硝基化水平所發(fā)揮抗氧化應激和抗炎作用有關。這將為研究動脈粥樣硬化的發(fā)生機制及其防治提供理論基礎。

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