李秀啟，劉　峰，冷春梅，董貫倉，王亞楠，師吉華

(山東省淡水漁業(yè)研究院，濟(jì)南 250013)

基于線粒體DNA控制區(qū)的南四湖湖鱭(Coiliaectenestaihuensis)群體遺傳結(jié)構(gòu)和種群擴(kuò)散*

李秀啟，劉峰，冷春梅，董貫倉，王亞楠，師吉華

(山東省淡水漁業(yè)研究院，濟(jì)南 250013)

摘要：為推斷南四湖湖鱭種群來源，采用線粒體控制區(qū)(D-loop)基因序列測(cè)定技術(shù)，對(duì)3個(gè)不同水域湖鱭(Coilia ectenes taihuensis)種群的遺傳結(jié)構(gòu)特征及其變異進(jìn)行研究，并分析它們之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系. 結(jié)果表明3個(gè)不同湖鱭種群的平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.9646和0.0097，除3個(gè)單倍型共享外，不同地理單元中具有較高的單倍型多樣性.AMOVA和成對(duì)Fst值分析均表明，不同湖泊群體間未發(fā)現(xiàn)明顯的遺傳分化，各地理單元中的單倍型相互散布在不同的種群中.系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，不同湖泊湖鱭種群的單倍型形成3個(gè)分支，但每一地理群體沒有顯示出明顯的地理位置與單倍型間的對(duì)應(yīng)關(guān)系.結(jié)合南四湖歷史資料和當(dāng)前漁業(yè)監(jiān)測(cè)結(jié)果，推測(cè)湖鱭為2002年實(shí)施長(zhǎng)江向南四湖應(yīng)急補(bǔ)水時(shí)洪澤湖湖鱭遷移擴(kuò)散進(jìn)而在南四湖建群的.

關(guān)鍵詞：湖鱭；線粒體D-loop區(qū)；遺傳結(jié)構(gòu)；種群擴(kuò)散；南四湖

*山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2008GG10006023)和山東省漁業(yè)資源修復(fù)項(xiàng)目聯(lián)合資助.2014-06-18收稿；2014-11-14收修改稿.李秀啟(1968～)，男，博士，副研究員；E-mail：xiuqili@sina.cn.

南四湖(34°26′～35°20′N，116°34′～117°21′E)屬淮河流域泗河水系，是我國北方最大的淡水湖，水域面積約1266km2，自北向南由南陽、獨(dú)山、昭陽和微山4個(gè)相連的湖區(qū)組成，周邊接納了來自魯、蘇、豫、皖4省53條河流的來水，屬河跡洼地淺水型湖泊[1].1960年二級(jí)壩樞紐工程將南四湖分成上級(jí)湖和下級(jí)湖，經(jīng)過多年的治理和建設(shè)，南四湖承擔(dān)著蓄水、防洪、排澇、漁業(yè)、灌溉、航運(yùn)、南水北調(diào)東線工程重要輸水通道和調(diào)蓄湖泊等多種功能.

刀鱭(Coiliaectenes)又名長(zhǎng)頜鱭，主要分布在中國、日本和朝鮮半島[2]，隸屬鯡形目鳀科鱭屬，為溯河洄游性魚類，但太湖、洪澤湖、巢湖等淡水湖泊分布著能夠自然繁殖的陸封型群體(即淡水定居性刀鱭)[3].袁傳宓等[4]根據(jù)形態(tài)和生態(tài)方面的差異將太湖群體定為刀鱭的新亞種，即太湖湖鱭(Coiliaectenestaihuensis).隨著長(zhǎng)江洄游性刀鱭的資源下降甚至消失，一些具有較大敞水面的長(zhǎng)江中、下游湖泊(如太湖和巢湖)中定居性湖鱭卻因湖泊魚類資源小型化以及繁殖保護(hù)措施的實(shí)施，資源量大幅增長(zhǎng)[5].

根據(jù)李思忠的《中國淡水魚類分布區(qū)劃》，南四湖魚類屬于江河平原區(qū)的河海亞區(qū)，魚類區(qū)系組成以我國特有的江河平原復(fù)合體魚類為主[6].受東亞季風(fēng)氣候、南四湖奪泗入淮、黃河的多次泛濫改道以及京杭大運(yùn)河航運(yùn)的影響，黃河、淮河、長(zhǎng)江和錢塘江水系相互貫通，促進(jìn)了各水域間魚類的相互滲透.黃河溯河洄游的刀鱭曾是南四湖、東平湖的主要經(jīng)濟(jì)魚類[7-8].1950s南四湖北與黃河水系貫通，洄游性魚類經(jīng)東平湖進(jìn)入南四湖大量繁殖，其中刀鱭年產(chǎn)量達(dá)2500t；1960s由于閘壩的興建洄游性魚類通道被阻斷，受氣候因素、湖區(qū)水文波動(dòng)和高強(qiáng)度的選擇性捕撈影響，1980s末洄游性魚類資源逐漸枯竭[1].

2002年南四湖遭遇枯水年份，南四湖的4個(gè)湖區(qū)幾乎全部干涸，水生生物和漁業(yè)資源遭受毀滅性破壞.2002年12月，國家防汛抗旱總指揮部和水利部實(shí)施了長(zhǎng)江向南四湖應(yīng)急生態(tài)補(bǔ)水工程.利用京杭大運(yùn)河蘇北段作為輸水路線，串聯(lián)洪澤湖、駱馬湖等湖庫，經(jīng)9級(jí)泵站提水北上，實(shí)現(xiàn)了江、淮、沂3大水系跨流域調(diào)水，1.1×108km3長(zhǎng)江水補(bǔ)入南四湖[9].自2007年以來，南四湖內(nèi)湖鱭(C.ectenestaihuensis)、間下鱵(Hyporhamphusintermedius)和大銀魚(Protosalanxhyalocranius)等魚類漁獲比例逐年增大，種群分布由航道逐步擴(kuò)展到敞水區(qū)，現(xiàn)已成為湖區(qū)自然漁業(yè)資源的優(yōu)勢(shì)物種.

探明南四湖湖鱭種群的來源以及擴(kuò)散途徑是客觀評(píng)價(jià)南水北調(diào)東線工程生態(tài)影響的現(xiàn)實(shí)問題.本研究以太湖、洪澤湖和南四湖的湖鱭為研究材料，采用線粒體控制區(qū)(D-loop)擴(kuò)展終止序列相關(guān)區(qū)(ETAS)序列研究不同水域種群的遺傳變異，揭示其遺傳多態(tài)性水平和種群擴(kuò)散的途徑，探討南四湖湖鱭的地理親緣關(guān)系，為評(píng)價(jià)南水北調(diào)東線工程對(duì)輸水沿線湖泊水環(huán)境生態(tài)影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

南水北調(diào)東線工程調(diào)水路線與太湖(30°55′～31°32′N，119°52′～120°36′E)、洪澤湖(33°06′～33°40′N，118°10′～118°52′E)、南四湖(34°26′～35°20′N，116°34′～117°21′E)湖鱭采樣點(diǎn)如圖1所示，標(biāo)本采集于2008年9月至2010年11月，分析標(biāo)本45尾，樣點(diǎn)信息見表1.

1.2 DNA的提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)及測(cè)序

采用標(biāo)準(zhǔn)的酚/氯仿法提取基因組DNA[10].參考Kocher等[11]的方法設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增引物為DL：5′-ACC CCT GGC TCC CAA AGC-3′；DH：5′-ATC TTA GCA TCT TCA GTG-3′. PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性30 s；55℃退火45 s，72℃延伸1 min；經(jīng)40個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min.采用Qiagen的QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收純化，在ABI 377 DNA測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序.所有序列已遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為KP053927～KP053956.

1.3 DNA序列數(shù)據(jù)分析

采用軟件ClustalX1.83[12]、SeaView[13]對(duì)測(cè)定后的序列進(jìn)行校正和排列.采用Arlequin 3.5.1.2[14]軟件統(tǒng)計(jì)種群核苷酸多樣性(π)、單倍型多樣性(h)、Tajima’sD和Fu’s中性檢驗(yàn).種群間的成對(duì)遺傳分化系數(shù)(Fst)分析群體間的分化程度，采用分子變異分析方法(AMOVA)評(píng)估湖鱭不同地理種群間遺傳變異的分布.以七絲鱭(C.grayii)(GenBank登錄號(hào)為EF419831和JX030383)mtDNA控制區(qū)序列作為外群，采用NJ法(neighbour-joining)[15]和貝葉斯法(bayesian inferences， BI)[16]，重建單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.NJ分析采用MEGA 6.0[17]軟件，系統(tǒng)樹分支的置信度采用自引導(dǎo)法(bootstrap analysis，BP)1000次重復(fù)檢測(cè).貝葉斯分析選用MrBayes v3.1.1程序[16]，運(yùn)算代數(shù)為1000000，burnin為20%.最適替代模型的選擇采用jModelTest 2.1.4程序[18]，選擇最適模型為HKY+I.

2 結(jié)果

2.1 mtDNA控制區(qū)序列變異分析

對(duì)所有序列進(jìn)行排列人工校對(duì)后，采用D-loop左側(cè)高變區(qū)序列長(zhǎng)度為499bp進(jìn)行分析.序列222～225bp之間存在6～7個(gè)38堿基(TTATGGTATAGTACATACTATGTATTATATTACATATA)串聯(lián)重復(fù).在所有湖鱭樣本中，共檢測(cè)到30種單倍型，除3種單倍型在多個(gè)種群間共享外，其余的單倍型在各種群之間不共享.其中，2種單倍型(單倍型h1和h2，圖2)在3個(gè)湖泊中均有分布，1種單倍型(單倍型h3)在2個(gè)湖泊中有分布，不同種群的私有單倍型數(shù)目均約為10個(gè).共檢測(cè)到35個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，簡(jiǎn)約位點(diǎn)13個(gè)，其中26個(gè)為堿基轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換/顛換比例為2.6.所有個(gè)體的單倍型多樣性(h)為0.9646，核苷酸多樣性(π)為0.0097(表1).不同種群間的h較相似，均大于0.9，而π范圍較大，為0.0057～0.0124.

表1 樣點(diǎn)信息和多樣性統(tǒng)計(jì)

表2 3個(gè)湖鱭種群間Fst統(tǒng)計(jì)值*

*對(duì)角線上方數(shù)值為顯著性P值；對(duì)角線下方數(shù)值為Fst值.

2.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

不同種群間成對(duì)Fst分析表明，3個(gè)湖鱭種群間的分化指數(shù)較低，太湖與洪澤湖湖鱭種群間差異最大，為0.0675，達(dá)到顯著分化水平(P=0.0344)；太湖與南四湖湖鱭種群間差異最小，為0.0236(P=0.1825)(表2).3個(gè)湖鱭種群的Tajima’sD和Fs值均為負(fù)值，其中Tajima’sD的范圍為-1.0912～-0.6527之間，F(xiàn)s的范圍為-6.4409～-4.2061之間(表1).AMOVA分析表明，遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，為總變異的95.63%，而種群間變異僅為4.37%(表1).

鄰接法構(gòu)建湖鱭種群的系統(tǒng)發(fā)育樹形成3個(gè)分支，但除來自太湖的h64、h70、h87和h93 4個(gè)單倍型聚成較高支持率的一支外(BP=67，BI=0.72)，其他分支支持率較低.各分支中均有3個(gè)湖泊個(gè)體，缺少明顯的可區(qū)分的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)(圖2).除來自太湖個(gè)體h160位于內(nèi)類群的基部外，BI和NJ結(jié)果在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上基本一致，3個(gè)地理種群所有單倍型也沒有聚成各自的分支.系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并沒有顯示出明顯的地理位置與單倍型間的對(duì)應(yīng)關(guān)系.

圖2 基于D-loop的ETAS序列構(gòu)建的3個(gè)湖鱭種群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(分支上的數(shù)值為NJ分析1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)得到的大于50的支持率；分支下的數(shù)值為BI分析后驗(yàn)概率；右側(cè)圓形的面積和顏色分別表示個(gè)體數(shù)和種群來源；黑色：太湖；灰色：洪澤湖；白色：南四湖)Fig.2 Phylogenetic relationships of ETAS sequence based on the D-loop region of C. ectenes taihuensis

3 討論

3.1 南四湖湖鱭的遺傳多態(tài)性

大量研究表明雖然長(zhǎng)江流域刀鱭的資源量下降，但種群內(nèi)仍存在較高的遺傳多樣性.長(zhǎng)江口鄰近水域不同刀鱭種群間存在較高的遺傳多樣性[19-21]，采用RAPD和ISSR標(biāo)記分析長(zhǎng)江口刀鱭種群也得到相似的結(jié)果[22].唐文喬等[23]的研究也表明，刀鱭、湖鱭及短頜鱭的線粒體控制區(qū)全序列中沒有發(fā)現(xiàn)共享單倍型的存在，說明刀鱭(含湖鱭及短頜鱭)雖然資源量減少，但仍具有較高的遺傳多樣性.高單倍型多樣性與其洄游、廣布、壽命較短、性成熟早等生活史特征有關(guān)[3，24].刀鱭為洄游性魚類，每年春、夏季由海入江河進(jìn)行生殖洄游，在長(zhǎng)江上游干支流或湖泊的緩流區(qū)產(chǎn)卵，產(chǎn)卵后返回近海索餌越冬.刀鱭的這種具有高擴(kuò)散潛能的生活習(xí)性增加了長(zhǎng)江干支流或湖泊各群體之間的基因交流，稀釋了它們之間由于地理隔離產(chǎn)生的變異，從而維持不同種群間較高的遺傳多樣性[25].雖然刀鱭種群具有較高的單倍型多樣性，但其核苷酸多態(tài)性相對(duì)較低，私有單倍型較多.這可能是環(huán)境因子改變，有效種群數(shù)量降低后，種群快速擴(kuò)張加速積累新突變所致[20，26].Tajima’sD和Fs值檢驗(yàn)均表明湖鱭種群經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，在變異的產(chǎn)生過程中，點(diǎn)突變雖可形成新的單倍型，快速增加種群的單倍型多樣性，但對(duì)π影響較小，π的增加需要比h的增加積累更長(zhǎng)的歷史時(shí)間.本研究3個(gè)湖鱭種群顯示較高的h，這與Cheng等[19]、Ma等[20]的研究結(jié)果一致.

外來種群往往由于奠基者效應(yīng)(founder effect)導(dǎo)致遺傳多樣性的降低，但有些物種在入侵后，種群遺傳多樣性并沒有顯著降低，其原因?yàn)檫M(jìn)入新的環(huán)境后通過雜交或變異，遺傳多樣性得以增加[27].程起群等[28]采用線粒體cytb分析刀鱭與湖鱭的遺傳關(guān)系，得出刀鱭的π值小于湖鱭的結(jié)論；認(rèn)為湖鱭遺傳多樣性水平增加是由于太湖自2000年夏季啟動(dòng)的“引江濟(jì)太”工程，每年引入10×108～15×108m3長(zhǎng)江水補(bǔ)充太湖，刀鱭有可能隨長(zhǎng)江水進(jìn)入太湖，并與湖鱭相互雜交，形成基因流，增加湖鱭遺傳多樣性水平和遺傳變異性.本研究3個(gè)湖泊中的湖鱭種群?jiǎn)伪缎蛿?shù)占總樣本數(shù)的67%，總體h較高，表明湖泊種群中湖鱭存在豐富的遺傳變異.本研究Fst分析表明，3個(gè)湖泊中湖鱭種群間的分化系數(shù)較低，太湖與洪澤湖湖鱭種群間差異最大，為0.0675，達(dá)到顯著分化水平，太湖與南四湖湖鱭種群間差異最小，為0.0236，遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，為總變異的95.63%，表明種群間存在較高的基因流.

3.2 湖鱭在南水北調(diào)湖群間的種群擴(kuò)散

Ma等[20]采用線粒體控制區(qū)序列分析我國東部地區(qū)10個(gè)種群刀鱭遺傳多樣性，AMOVA和Fst分析均顯示10個(gè)種群之間存在一定的分離，基因交流受到限制.本研究通過鄰接法構(gòu)建湖鱭種群的系統(tǒng)發(fā)育樹、貝葉斯樹和NJ拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上基本一致，3個(gè)地理種群所有單倍型雖然沒有聚成各自的分支、沒有顯示出明顯的地理位置與單倍型間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，但另一方面解釋了南四湖湖鱭和長(zhǎng)江淮河水系中群體親緣關(guān)系較近.

湖泊中外來魚類的移入包括人工增殖放流和水體間自然交流，其中水系間的連通是魚類擴(kuò)散的主要途徑.歷史上南四湖由南北大運(yùn)河連接，北接?xùn)|平湖連通黃河，南經(jīng)駱馬湖、洪澤湖可達(dá)長(zhǎng)江，京杭大運(yùn)河使上述湖沼濕地水體間存在聯(lián)系和交流，是我國東部水系間南北物種交流的一條重要廊道.然而最近幾十年來在氣候變化及人為干擾下大運(yùn)河廊道已處于癱瘓狀態(tài)，僅在夏季暴雨時(shí)南四湖才向淮河下游泄洪，2002年12月，利用京杭大運(yùn)河向南四湖生態(tài)補(bǔ)水打破物種原有湖泊間的隔離，為生物類群提供一個(gè)短期、快速遷移的機(jī)會(huì).根據(jù)洪澤湖[29]、駱馬湖[30-31]魚類資源狀況調(diào)查結(jié)果，湖鱭、大銀魚、間下鱵等敞水區(qū)上層魚類分別為上述湖中的優(yōu)勢(shì)種群.雖然目前的分子生物學(xué)結(jié)果還不能提供充分的證據(jù)支持南四湖群體來自洪澤湖，但是結(jié)合歷史漁業(yè)資料[32-33]和監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，我們初步推測(cè)湖鱭是2002年經(jīng)由京杭大運(yùn)河從長(zhǎng)江和淮河水系的洪澤湖、駱馬湖生態(tài)補(bǔ)水進(jìn)入南四湖擴(kuò)散建群的，為長(zhǎng)江刀鱭一個(gè)陸封型群體.進(jìn)一步采用其他標(biāo)記(如微衛(wèi)星)、增加樣本量和地理群體有助于探討這一科學(xué)問題.

湖鱭獨(dú)特的生態(tài)習(xí)性和生活史特征使其更易拓殖新的棲息地并快速建群和擴(kuò)張.湖鱭喜集群，游泳迅速，具有較強(qiáng)的種群擴(kuò)散能力[5]，而且湖鱭性成熟早，當(dāng)年魚即可參加產(chǎn)卵群體，而且魚卵分批產(chǎn)出，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，湖鱭產(chǎn)卵期為4月底至7月底，產(chǎn)浮性卵，為多次分批產(chǎn)卵，這樣保證了幼魚的存活率和食料的可得性.漁獲物中湖鱭一冬齡個(gè)體占90%以上，補(bǔ)充群體數(shù)量較大[5，34-35].本課題組2007年漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)結(jié)果表明：湖鱭在南四湖漁獲物中所占比例逐年增大，種群分布范圍湖鱭分布區(qū)從下級(jí)湖到上級(jí)湖，從運(yùn)河主航道擴(kuò)展到整個(gè)湖的敞水區(qū)，低齡個(gè)體呈現(xiàn)快速增加的趨勢(shì).2008年9月以來，南四湖下級(jí)湖以微山島、西平水域較多，上級(jí)湖以兩城水域較多，湖區(qū)湖鱭日捕撈產(chǎn)量在1000kg以上.體長(zhǎng)一般為20～30cm，絲網(wǎng)捕撈單船日產(chǎn)量為15kg左右，捕撈一直能持續(xù)到11月.2010年11月，在下級(jí)湖單船日最高捕撈產(chǎn)量達(dá)到750kg，表明遷入的湖鱭已成為南四湖自然漁業(yè)資源的優(yōu)勢(shì)種群之一.

南水北調(diào)工程是我國實(shí)現(xiàn)水資源優(yōu)化配置的戰(zhàn)略舉措，東線工程從長(zhǎng)江下游揚(yáng)州抽引水，利用京杭大運(yùn)河及與其平行的河道逐級(jí)提水北送，并連接起調(diào)蓄作用的洪澤湖、駱馬湖、南四湖和東平湖.南水北調(diào)工程的運(yùn)行將使地區(qū)間的物種遷移和基因交流變得更為頻繁，從而深刻地影響著輸水沿線和受水區(qū)的生態(tài)過程.2002年南四湖生態(tài)補(bǔ)水作為南水北調(diào)東線調(diào)水的一次預(yù)演，為東線調(diào)水對(duì)沿線湖泊水生生物的影響提供了證據(jù).2013年南水北調(diào)東線工程全線通水運(yùn)行后，南四湖湖鱭已沿梁濟(jì)運(yùn)河進(jìn)入東平湖成功建群就是一個(gè)例證[36]，其能否進(jìn)入黃河有待進(jìn)一步的監(jiān)測(cè).

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?2015 byJournalofLakeSciences

Genetic structure and diffusion of population ofCoiliaectenestaihuensisin Lake Nansi inferred from the mitochondrial control region

LI Xiuqi， LIU Feng， LENG Chunmei， DONG Guancang， WANG Yanan & SHI Jihua

(FreshwaterFisheriesResearchInstituteofShandong，Jinan250013，P.R.China)

Abstract：The genetic structure and genetic variation of three populations of Coilia ectenes taihuensis in different lakes are investigated using the mitochondrial control region gene. Results show that the hapotype diversity(h) and mean nucleotide diversity(π) of the populations of different lakes are 0.9646 and 0.0097， respectively. 30 hapotypes were detected out of 45 individuals from the three populations. Only three of these haplotypes were shared among three lakes which contributed much to the genetic diversity. The AMOVA analysis and the pairwise Fstvalues revealed no significance among three populations of C. ectenes taihuensis. NJ and Bayesian analyses revealed that individuals of three populations formed three clades with poor support， but no clear relationships between haplotypes and geographical regions. We inferred that C. ectenes taihuensis populations in Lake Nansi originate from lakes in the Yangtze River by the ecological urgent water diversion in 2002.

Keywords：Coilia ectenes taihuensis； mtDNA control region； genetic structure； population dispersal; Lake Nansi

DOI10.18307/2015.0417