陳迪，王連生，徐奇友

(1．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306;2．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150070)

谷氨酰胺 (Glutamine，Gln)是血液循環(huán)和組織內(nèi)游離氨基酸池中含量最豐富的一種氨基酸［1］，對(duì)機(jī)體具有多方面的影響。隨著人們對(duì)Gln研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)其在腸道營養(yǎng)與免疫等方面作用突出。許多研究表明，Gln是條件性必需氨基酸，也是胃腸道管腔細(xì)胞的基本能量來源，并在維持早期斷奶仔豬腸道結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用，如促進(jìn)腸黏膜組織在應(yīng)激損傷后的修復(fù)，為腸道提供轉(zhuǎn)運(yùn)能源，為核酸的生物合成提供胺氮等［1］。在生產(chǎn)實(shí)踐中，Gln因單體穩(wěn)定性差、溶解度低、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)限制了其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用。近年來，α-酮戊二酸 (α-ketoglutarate，AKG)作為Gln的前體物質(zhì)，其良好的穩(wěn)定性及在體內(nèi)能迅速為腸道供能等特性引起了研究者的廣泛關(guān)注，國內(nèi)外對(duì)一些醫(yī)學(xué)和動(dòng)物科學(xué)的研究表明，AKG在腸道營養(yǎng)與免疫作用中具有可替代Gln的功效。AKG是生物體三羧酸循環(huán)重要的中間體，也是谷氨酸家族氨基酸如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸等的生物合成前體［2］。目前，已有學(xué)者對(duì)AKG在仔豬、肉仔雞和大鼠的生長、腸道發(fā)育和抗氧化能力等方面做了相關(guān)研究［3-7］，位瑩瑩等［8］研究了AKG對(duì)松浦鏡鯉生長及血清生化指標(biāo)等的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加適量的AKG可以在一定程度上降低飼料系數(shù)，提高魚體的增重率和蛋白質(zhì)效率，并最終起到促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪代謝的作用。而有關(guān)AKG對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物影響的研究仍然不夠全面，有待于進(jìn)一步深入探討。

西伯利亞鱘Acipenser schrenckii♀和史氏鱘Acipenser baeri♂的雜交鱘是目前生產(chǎn)上飼養(yǎng)的主要品種，其生長速度較快，5個(gè)月內(nèi)可長到0．5 kg左右，本試驗(yàn)中以其為研究對(duì)象，研究了不同蛋白源條件下添加AKG的飼料對(duì)雜交鱘腸道形態(tài)、消化酶活力和抗氧化能力的影響，以期為AKG在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用雜交鱘購自北京房山鱘魚養(yǎng)殖基地。AKG(純度≥98．5%)購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1．2．1 飼料的配制 根據(jù)鱘魚幼魚營養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)飼料。試驗(yàn)采用進(jìn)口蒸汽魚粉為動(dòng)物蛋白源，以大豆?jié)饪s蛋白為植物蛋白源，以混合油 (大豆磷脂、魚油、豆油)為脂肪源，試驗(yàn)飼料理論蛋白質(zhì)水平為39%，分為大豆?jié)饪s蛋白源組以及魚粉與大豆?jié)饪s蛋白的復(fù)合蛋白源組，每組設(shè)兩個(gè)AKG水平 (0和1%)，配制4種試驗(yàn)飼料，試驗(yàn)飼料的組成和營養(yǎng)成分見表1。將各種飼料原料粉碎過80目篩，逐級(jí)混合均勻，再加入一定量的水充分混合并用小型顆粒機(jī)擠壓成顆粒飼料，常溫下風(fēng)干后，儲(chǔ)存于冰箱 (-20℃)中。

1．2．2 試驗(yàn)分組及飼養(yǎng)管理 將試驗(yàn)魚用食鹽水(濃度為30 g/L)消毒后養(yǎng)殖于車間的可控溫循環(huán)水系統(tǒng)中，馴養(yǎng) 2周后，將體質(zhì)量為 (7．65±0．04)g的健康雜交鱘500尾隨機(jī)分為4組，每組設(shè)5個(gè)平行，每個(gè)平行放25尾魚。試驗(yàn)用水為曝氣的自來水，水溫保持在22℃左右，溶氧大于5 mg/L，自然光照。試驗(yàn)期間飽食投喂，每天8:00、13:00、17:00投餌，及時(shí)吸取殘餌和糞便，定期檢測水質(zhì)，每7天換水1次，確保水質(zhì)良好。養(yǎng)殖周期為8周。

1．2．3 樣品的采集與處理 試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚饑餓24 h，使其完全排空腸胃中的食物，然后進(jìn)行樣品采集。從每組隨機(jī)取10尾魚，并用濃度為100 mg/L的MS-222麻醉，置于冰盤上解剖，取出腸道，稱重并測量腸道長度，剔除腸道上的附屬物，用濾紙吸去腸道表面水分，再稱重后加入9倍質(zhì)量的8．6 g/L的生理鹽水勻漿，以4000 r/min離心20 min，取上清液，分裝后于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．4 腸道Gln含量和谷氨酰胺合成酶 (GS)活性的測定 采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定Gln含量和GS活性。Gln含量的測定原理為Gln在GS的作用下反應(yīng)生成谷氨酸和氨，通過測定氨的含量來計(jì)算Gln的量。

GS酶活力單位定義為:在37℃下，每小時(shí)反應(yīng)生成1 μmol γ-谷氨酰氧肟酸的量為1個(gè)酶活力單位 (U)。

1．2．5 腸道形態(tài)指標(biāo)的測定 從每組隨機(jī)取10尾魚，麻醉后分離前腸、中腸和后腸，取腸道中段1 cm左右的腸段放入Bouin氏液中，逐級(jí)脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、H．E染色、脫水、透明、中性樹膠封片，用Motic顯微圖像系統(tǒng) (Motic Images Plus 2．0軟件)測量腸道絨毛高度、隱窩深度和皺襞厚度。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平 (風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Ingredients and approximate composition of the experimental diets(air－dry basis) w/%

1．2．6 腸道消化酶活力的測定 采用福林-酚(Folin-phenol)法測定蛋白酶活力。福林-酚試劑在堿性溶液中極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原為藍(lán)色化合物，本試驗(yàn)中使用0．5%的酪素作為底物與酶液反應(yīng)，生成含酚基的氨基酸與福林-酚試劑成藍(lán)色反應(yīng)，可從藍(lán)色的深淺測知酶活力的多少，在680 nm波長下比色，測定光密度。蛋白酶活力單位定義為:在37℃下，每分鐘水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位 (U)。

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定脂肪酶活力，具體方法參見試劑盒說明書。脂肪酶活力單位定義為:在37℃下，每克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個(gè)酶活力單位 (U)。

采用淀粉-碘比色法測定淀粉酶活力，以0．04%可溶性淀粉為底物，與酶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后加入的碘液與未被水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物，將藍(lán)色的深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的空白管比較，測定其吸光度，從而推算出淀粉酶活力的大小。淀粉酶活力單位定義為:在37℃下，30 min內(nèi)100 mL酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10 mg為一個(gè)淀粉酶活力單位 (U)。

1．2．7 腸道抗氧化指標(biāo)的測定 采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定腸道超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶 (CAT)活力和微量還原型谷胱甘肽 (GSH)、丙二醛 (MDA)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以不同蛋白源和AKG濃度為影響因素，采用SPASS 17．0軟件進(jìn)行雙因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組雜交鱘腸道Gln含量和GS活性的變化

從表2可見:AKG能顯著提高腸道Gln含量和GS活性 (P＜0．05);不同蛋白源對(duì)腸道Gln含量和GS活性均無顯著影響 (P＞0．05);蛋白源和AKG對(duì)腸道Gln含量和GS活性無交互作用 (P＞0．05)。

2.2 各組雜交鱘腸道形態(tài)的變化

從表3可見:AKG能顯著提高后腸絨毛高度(P＜0．05);不同蛋白源對(duì)腸道形態(tài)均無顯著影響(P＞0．05);蛋白源和AKG對(duì)腸道形態(tài)無交互作用(P＞0．05)。

2.3 各組雜交鱘腸道消化酶活力的變化

從表4可見:AKG能顯著提高蛋白酶活性(P＜0．05)，對(duì)脂肪酶和淀粉酶無顯著性影響 (P＞0．05);大豆?jié)饪s蛋白源可顯著提高蛋白酶活性(P＜0．05)，復(fù)合蛋白源可顯著提高腸道淀粉酶活性 (P＜0．05);蛋白源與AKG對(duì)脂肪酶和淀粉酶活力有交互作用 (P＜0．05)。

表2 AKG對(duì)雜交鱘腸道Gln含量和GS活性的影響 (n=10)Tab.2 Effects of AKG on glutamin(Gln)content and glutamine synthetase(GS)activity in intestine of hybrid sturgeon(n=10)

2.4 各組雜交鱘腸道抗氧化能力的變化

從表5可見:AKG能顯著提高腸道中SOD活性 (P＜0．05)，并顯著降低MDA含量 (P＜0．05)，對(duì)CAT活性和GSH含量無顯著影響 (P＞0．05);不同蛋白源對(duì)腸道抗氧化能力均無顯著影響 (P＞0．05);蛋白源與AKG對(duì)MDA含量有交互作用(P＜0．05)，對(duì)其他抗氧化指標(biāo)均無交互作用 (P＞0．05)。

3 討論

3.1 AKG對(duì)雜交鱘腸道Gln含量和GS活性的影響

AKG不僅是生物體三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，也是谷氨酸家族氨基酸的生物合成前體。AKG進(jìn)入魚體后在一系列酶的催化作用下可以迅速生成谷氨酸，并進(jìn)一步形成Gln。研究表明，飼料中添加Gln可改善水生動(dòng)物的生長性能、腸道發(fā)育和免疫力［9-11］。本試驗(yàn)中，AKG顯著提高了雜交鱘腸道Gln的含量，其機(jī)理可能是AKG進(jìn)入魚體后經(jīng)一系列反應(yīng)生成了Gln。腸道是Gln最主要的消耗器官［12］，所以腸道的Gln含量顯著增加，而酶活性隨著底物濃度的增加而增強(qiáng)，Gln含量增加進(jìn)而使得GS活性也相應(yīng)增強(qiáng)。本研究表明，添加AKG可以增加腸道Gln含量。

表3 AKG對(duì)雜交鱘腸道形態(tài)的影響 (40×10倍光鏡)(n=10)Tab.3 Effects of AKG on intestinal morphology of hybrid sturgeon(40×10)(n=10) μm

表4 AKG對(duì)雜交鱘腸道消化酶活力的影響 (n=10)Tab.4 Effects of AKG on intestinal digestive enzyme activity in hybrid sturgeon(n=10) U/g

3.2 AKG對(duì)雜交鱘腸道形態(tài)的影響

小腸是碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等主要營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要器官［13］，其內(nèi)黏膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性是養(yǎng)分消化吸收、動(dòng)物正常生長與生產(chǎn)的基本保證，若腸黏膜發(fā)育不良或受損，將嚴(yán)重影響動(dòng)物的生長、發(fā)育和免疫功能等，最終也會(huì)使經(jīng)濟(jì)效益受損。小腸的絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度等是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。腸絨毛是小腸黏膜表面上皮和固有層向腸腔內(nèi)的細(xì)小突起，是動(dòng)物機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的最主要部位，在十二指腸和空腸中分布最為密集。絨毛高度和黏膜厚度增加，小腸與營養(yǎng)物質(zhì)的相對(duì)接觸面積就會(huì)變大，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收就會(huì)更有利。研究表明，外源性的Gln可以提高鯉腸道絨毛高度，促進(jìn)腸道發(fā)育［14］。本試驗(yàn)條件下，AKG能顯著提高后腸絨毛高度，其作用機(jī)理可能是，AKG進(jìn)入雜交鱘體內(nèi)經(jīng)反應(yīng)生成Gln，Gln可使腸黏膜功能性表面積增大，進(jìn)而使得腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收增大。本研究表明，添加AKG可以在一定程度上促進(jìn)腸道發(fā)育。

表5 AKG對(duì)雜交鱘腸道抗氧化能力的影響 (n=10)Tab.5 Effects of AKG on intestinal antioxidant capacity in hybrid sturgeon(n=10)

3.3 AKG對(duì)雜交鱘腸道消化酶活力的影響

魚類的消化酶活性決定魚類對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，進(jìn)而決定魚類的生長發(fā)育速度。魚體內(nèi)的消化酶主要分為蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，對(duì)于不同食性和生活習(xí)慣的魚，其體內(nèi)3種酶的活力是不同的，且消化酶的變化可能跟飼料中的添加物有關(guān)［15］。腸在魚類消化過程中起著重要的作用，是主要的消化器官。因此，了解魚類腸道消化酶的分泌、貯存機(jī)制，以及其如何消化吸收營養(yǎng)成分是非常必要的。本試驗(yàn)中，AKG能顯著增加蛋白酶活性，其機(jī)理可能是，AKG進(jìn)入魚體后，經(jīng)一系列反應(yīng)生成Gln，Gln可以促進(jìn)腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。林燕［14］研究表明，飼料中添加適宜的Gln可促進(jìn)幼建鯉腸細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，從而影響腸道的生長發(fā)育。此外，AKG還可以有效促進(jìn)氮的代謝，減輕動(dòng)物生產(chǎn)中的代謝應(yīng)激，保護(hù)氨基酸作為能量被腸道利用，并起到節(jié)約氨基酸的作用。由此可知，AKG在促進(jìn)機(jī)體及組織蛋白質(zhì)的合成中起到了重要作用。本研究表明，添加AKG可促進(jìn)雜交鱘腸道消化吸收，提高腸道蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而增強(qiáng)其蛋白酶活性。

3.4 AKG對(duì)雜交鱘腸道抗氧化能力的影響

酶和非酶系統(tǒng)構(gòu)成了水產(chǎn)動(dòng)物的主要抗氧化防御系統(tǒng)，兩者協(xié)作可以有效清除機(jī)體內(nèi)的活性氧等自由基及其代謝產(chǎn)物，測定抗氧化酶系的活性常用于評(píng)估體內(nèi)自由基反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化及組織損傷情況［16］?？寡趸赶抵饕⊿OD、GSH-PX、CAT等，非酶系統(tǒng)主要包括 GSH、VE、VC 等［17］。SOD作用于超氧自由基，使魚體內(nèi)的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，從而清除機(jī)體內(nèi)的自由基，保護(hù)機(jī)體免受損傷。MDA作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，是生物體內(nèi)自由基的指示物，并廣泛作為各種氧自由基損傷機(jī)體的指標(biāo)。動(dòng)物組織里的MDA能使核酸、蛋白質(zhì)和腦磷脂發(fā)生交聯(lián)而喪失活性。因此，測定MDA含量可以反映機(jī)體脂質(zhì)氧化的程度，從而間接反映機(jī)體細(xì)胞組織受損傷和肌肉品質(zhì)變化的嚴(yán)重程度。魚類組織中含有大量多不飽和脂肪酸以維持細(xì)胞膜的必須功能［18］，因此，魚類極易受到自由基攻擊，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷［19］。由于水生動(dòng)物腸道與外界水環(huán)境相通，腸道抗氧化能力在一定程度上反映了腸黏膜防御屏障的發(fā)育程度。本試驗(yàn)條件下，AKG能顯著提高腸道中SOD活性，降低MDA含量，表明AKG有效改善了腸道的抗氧化能力，這與胡泉州等［20］對(duì)斷奶仔豬血漿的研究結(jié)果一致。其機(jī)理可能是，AKG進(jìn)入魚體后經(jīng)反應(yīng)生成Gln，Gln可以作為能源物質(zhì)氧化，清除細(xì)胞內(nèi)的一些強(qiáng)氧化性物質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)一些重要組分免受氧化性損害［21］，最終達(dá)到提高機(jī)體抗氧化能力的目的。本研究表明，添加AKG可以提高腸道的抗氧化能力。

［1］Rhoads M J，Wu G．Glutamine，arginine，and leucine signaling in the intestine［J］．Amino Acids，2009，37(1):111-122．

［2］Wu G，Meier S A，Knabe D A．Dietary glutamine supplementation prevents jejuna atrophy in weaned pigs［J］．The Journal of Nutrition，1996，126:2578-2584．

［3］余親平，陳雁群，謝金蟬，等．日糧添加α-酮戊二酸對(duì)肉仔雞生長性能及組織器官發(fā)育的影響［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(10):10-14．

［4］Buddington R K，Pajor A，Buddington K K，et al．Absorption of αketoglutarate by the gastrointestinal tract of pigs［J］．Comparative Biochemistry and Physiology，Part A:Molecular＆ Integrative Physiology，2004，138(2):215-220．

［5］Hou Yongqing，Wang Lei，Ding Binying，et al．Dietary α-ketoglutarate supplementation ameliorates intestinal injury in lipopolysaccharide-challenged piglets［J］．Amino Acids，2010，39:555-564．

［6］Segaud F，Combaret L，Neveux N．Effects of ornithine α-ketoglutarate on protein metabolism in Yoshida sarcoma-bearing rats［J］．Clinical Nutrition，2007，26:624-630．

［7］羅金升，項(xiàng)方獻(xiàn)，張磊，等．中草藥結(jié)合α-酮戊二酸促進(jìn)仔豬生長發(fā)育的研究［C］//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集．北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2010:421-427．

［8］位瑩瑩，徐奇友，李晉南，等．不同蛋白質(zhì)水平飼料中添加α-酮戊二酸對(duì)松浦鏡鯉生長性能、體成分和血清生化指標(biāo)的影響［J］．動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013，25(12):2958-2965．

［9］葉元土，王永玲，蔡春芳，等．谷氨酰胺對(duì)草魚腸道L-亮氨酸、L-脯氨酸吸收及腸道蛋白質(zhì)合成的影響［J］．動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2007，19(1):28-32．

［10］徐奇友，王常安，許紅，等．丙氨酰Ala-Gln對(duì)哲羅魚仔魚生長和抗氧化能力的影響［J］．動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2009(6):1012-1017．

［11］徐奇友，王常安，許紅，等．外源性谷氨酰胺對(duì)虹鱒稚魚生長和腸道形態(tài)的影響［J］．中國糧油學(xué)報(bào)，2009，24(4):98-102．

［12］姜俊，周小秋．Gln對(duì)鯉魚腸上皮細(xì)胞增殖和分化的影響［C］//第五屆全國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)．北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006:167．

［13］胡泉舟，侯永清，丁斌鷹，等．α-酮戊二酸對(duì)仔豬小腸組織學(xué)形態(tài)與功能的影響［J］．動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，20(6):662-667．

［14］林燕．谷氨酰胺對(duì)幼建鯉腸道功能和免疫力的影響［D］．雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005．

［15］Hidalgo M C，Urea E，Sanz A．Comparative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habits:proteolytic and amylase activities［J］．Aquaculture，1999，170(3):267-283．

［16］許治沖，劉暉，徐奇友，等．溫度和飼料脂肪水平對(duì)松浦鏡鯉免疫及抗氧化能力的影響［J］．大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(5):429-435．

［17］周婷婷，曹俊明，趙紅霞，等．谷胱甘肽在水產(chǎn)動(dòng)物中的營養(yǎng)生理作用研究進(jìn)展［J］．水產(chǎn)科學(xué)，2012，31(10):630-634．

［18］Martlnez-Alvarez R M，Morales A E，Sanz A．Antioxidant defenses in fish:biotic and abiotic factors［J］．Fish Biology and Fisheries，2005，15(1/2):75-88．

［19］Oruc E O，Usta D．Evaluation of oxidative stress responses and neurotoxicity potential of diazinon in different tissues of Cyprinus carpio［J］．Environmental Toxicology and Pharmacology，2007，23(1):48-55．

［20］胡泉舟，侯永清，丁斌鷹，等．α-酮戊二酸對(duì)斷奶仔豬生長性能和腸道功能的影響［C］//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集．北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008:362．

［21］王學(xué)斌，劉鳳蓮，李東風(fēng)，等．體內(nèi)游離谷氨酰胺的抗氧化作用［J］．生物物理學(xué)報(bào)，2005，20(6):429-433．