劉 靜，權(quán)春善，瞿曉晶，陳 瑩，宗子超

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連116605)

構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera)屬?？浦绷⒙淙~喬木，在中國的溫帶、熱帶區(qū)域均有分布，平原或山丘均能生長。構(gòu)樹具有生長迅速、適應(yīng)力強(qiáng)、分布廣、易繁殖、熱量高、輪伐期短等特性。構(gòu)樹葉可制作成動物飼料;構(gòu)樹液可消腫解毒，治水腫癬疾;構(gòu)樹果，名為褚實(shí)子，可生食，亦可釀酒，有補(bǔ)腎、強(qiáng)筋骨、明目、利尿、健脾等功效［1］。目前構(gòu)樹內(nèi)黃酮、生物堿類等成分已經(jīng)被探究［2］，而關(guān)于構(gòu)樹種子油中成分的報(bào)道很少，因還未知種子油的最佳提取方法，導(dǎo)致對其還缺乏深入的研究。

本文利用超聲波強(qiáng)化提取技術(shù)高效提取構(gòu)樹種子油，在此基礎(chǔ)上采用分子熒光法和GC -MS技術(shù)［3］測定并分析了維生素E(VE)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脂肪酸成分。通過對構(gòu)樹種子油的分析，以期為構(gòu)樹種子的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

構(gòu)樹種子采摘于大連民族大學(xué)校內(nèi)，將其洗凈、烘干、研碎后置于干燥器中備用。

1.2 儀器及試劑

超聲波細(xì)胞破碎儀(CP501/8893E-MT，寧波新芝生物科技股份有限公司);高速離心機(jī)(CT15RT，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R -200，Switzerland);熒光分光光度計(jì)(RF -5301PC，日本島津);氣相色譜儀(GC-2010，日本島津);氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-QP2010，日本島津);其他均為實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

丙酮、無水乙醇、甲醇、三氟化硼乙醚、正己烷均為分析純;VE 標(biāo)準(zhǔn)樣品、亞油酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度＞99%)(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 種子油的超聲波強(qiáng)化提取

根據(jù)文獻(xiàn)［4 -5］，試驗(yàn)得出最適提取方法如下:將已研磨的構(gòu)樹種子35 g 放入燒杯中，按照1∶12 的物料比加入丙酮420 mL，以65 %的強(qiáng)度對其進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎7 min，以10 000 r·min-1的速率離心10 min，取上清液，丟棄殘?jiān)?。?0 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至油狀物并恒重。構(gòu)樹種子油提取率(E)計(jì)算式為

1.3.2 種子油VE 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

以無水乙醇精確配制質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的VE 標(biāo)準(zhǔn)溶液，在熒光分光光度計(jì)上掃描調(diào)試以確定激發(fā)波長與發(fā)射波長。再用無水乙醇配制質(zhì)量濃度分別為6，8，10，12，14 μg·mL-1的VE 溶液，繪制VE 標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后在已測定的激發(fā)波長與發(fā)射波長條件下測定質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的構(gòu)樹種子油的VE 質(zhì)量分?jǐn)?shù)。構(gòu)樹種子油VE 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C1)計(jì)算式為

1.3.3 種子油甲酯化及氣相色譜分析

種子油甲酯化:取種子油0.2 g 至10 mL 離心管，加5 % KOH - CH3OH 1. 0 mL，水浴鍋中以60℃水浴30 min，冷卻至室溫后加14 % BF3-CH3OH 3.0 mL，60℃水浴3 min，冷卻至室溫后用2 mL 正己烷輕輕上下顛倒數(shù)次混勻萃取，靜置分層，取上清液待測。構(gòu)樹種子油的質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1。對上清液進(jìn)行氣相色譜分析:色譜柱為RxiTM-5ms 毛細(xì)管柱(60 m ×0. 25 mm ×0. 25 μm)，柱前壓24.52 Pa，載氣為高純氦氣，流速0.4 mL·min-1。柱升溫程序:初始溫度180℃，保持1 min，以2℃·min-1升溫至200℃，保持20 min，再以4℃·min-1升溫至220℃，保持10 min。

1.3.4 構(gòu)樹種子油中亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

精確稱量亞油酸標(biāo)準(zhǔn)樣品12. 4 mg，加400 μL 正己烷，搖勻后取50 μL 溶液加1 000 μL 正己烷稀釋，分別取50，100，150，200 μL 溶液用正己烷定容到1 000 μL，制得質(zhì)量濃度分別為0.07，0.155，0. 233，0. 310 μg·μL-1的亞油酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)以上條件的氣相色譜檢測分析，構(gòu)樹種子油中亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C2)計(jì)算式為

2 結(jié)果與討論

2.1 種子油的提取

通過超聲波強(qiáng)化方法提取構(gòu)樹種子油，測得油的恒重質(zhì)量為9.85 g，其提取率為28.14 %。

操作過程中，最影響提油率的是超聲波破碎的強(qiáng)度，強(qiáng)度越大，空化現(xiàn)象越劇烈，媒質(zhì)粒子速度和加速度亦越大，界面擴(kuò)散層上分子擴(kuò)散就越快，從而提取率就越高。超聲波破碎法最大程度地保持了種子油中原有的成分，使其脂肪酸等成分的分析數(shù)據(jù)更具可靠性。

2.2 熒光檢測波長的選擇

初始激發(fā)波長Ex 為270 nm，后以10 nm 梯度遞增至320 nm，發(fā)射波長范圍設(shè)定在Em=300 ～600 nm，逐步縮小激發(fā)波長梯度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ex=298 nm，Em=326 nm 時(shí)出現(xiàn)最大峰值，故確定本方法的激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為298 nm和326 nm。

2.3 種子油VE 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

在Ex=298 nm，Em=300 ～600 nm 條件下用熒光分光光度計(jì)測定不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。構(gòu)樹種子油在同等條件測得Em=329 nm 處熒光強(qiáng)度為218.3，查出樣品的VE 質(zhì)量濃度為8.209 μg·mL-1，計(jì)算可得，植物油VE 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04 %，即410.45 mg·kg-1。

2.4 種子油的脂肪酸分析

對已甲酯化的構(gòu)樹種子油樣品進(jìn)行氣相色譜分析，適當(dāng)微調(diào)流動相流速以獲得分離較好的色譜峰。以相同條件對樣品進(jìn)行質(zhì)譜定性分析，結(jié)果如圖1。

圖1 構(gòu)樹種子油GC-MS 中總離子流圖

構(gòu)樹種子油的總離子流圖中共31 個(gè)峰，經(jīng)化合物庫檢索并依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6］，共鑒定出15 種成分，主要含有棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、珠光脂酸等脂肪酸，利用歸一化法計(jì)算出每種脂肪酸占總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1。

表1 構(gòu)樹種子油脂肪酸成分

構(gòu)樹種子油中有與人體健康息息相關(guān)的5 種不飽和脂肪酸，其中亞油酸、油酸分別占總不飽和脂肪酸的17.1 %和15.7 %。

2.5 種子油亞油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

亞油酸人體不能自身合成，必須從外界攝取。經(jīng)氣相色譜檢測分析，亞油酸標(biāo)準(zhǔn)樣品在16. 8 min 左右出現(xiàn)單峰，且樣品在16.8 min 出現(xiàn)峰面積為47712.3 的峰，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從中查出樣品的亞油酸質(zhì)量濃度值為0.078 μg·μL-1，計(jì)算可知種子油亞油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.007 8 %，即77.984 mg·kg-1。

3 結(jié) 語

構(gòu)樹種子油中的VE 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為410.45 mg·kg-1，而杏仁油、花生油、橄欖油、鷹嘴豆油、巴旦木油、菜籽油、棉籽油等VE 質(zhì)量分?jǐn)?shù)均未超過400 mg·kg-1，因此構(gòu)樹種子油的VE 含量較高。對構(gòu)樹種子油的脂肪酸組成進(jìn)行分析，飽和脂肪酸主要有棕櫚酸、硬脂酸、花生酸，不飽和脂肪酸主要有亞油酸、油酸。不飽和脂肪酸中，亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為17.1 %。綜上所述，構(gòu)樹種子油具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，對人體健康有很重要的影響，故可應(yīng)用于食品加工、生物制藥等行業(yè)。

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