雷燕，戚瑞榮，崔龍波，肖洋，張文文，馬家好，王雪鵬

(1．廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東廣州510515;2．廣州金水動(dòng)物保健品有限公司，廣東 廣州510515;3．煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005;4．山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018)

大口黑鱸Micropterus salmoides俗稱加州鱸、黑鱸，隸屬于鱸形目Perciformes、鱸亞目 Porcoidei、太陽魚科Cehtrachidae、黑鱸屬M(fèi)icropterus，原產(chǎn)于美國加利福尼亞州密西西比河水系，是一種肉質(zhì)鮮美、抗病力強(qiáng)、生長迅速、易起捕的名貴肉食性魚類。大口黑鱸的適溫范圍廣，耐低氧能力強(qiáng)，喜歡棲息于沙質(zhì)或沙泥質(zhì)不混濁的靜水環(huán)境中。

廣東佛山于1983年引進(jìn)大口黑鱸，并于1985年人工繁殖成功，魚種被廣泛養(yǎng)殖，均取得較好的經(jīng)濟(jì)效益。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，大口黑鱸的病害問題日顯突出，如爛鰓病、潰瘍病、諾卡氏菌病、車輪蟲病、虹彩病毒病等。近年來，廣東佛山地區(qū)的養(yǎng)殖場經(jīng)常暴發(fā)大口黑鱸魚種大規(guī)模死亡的流行性疾病，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2014年6月，廣東省佛山市倫教鎮(zhèn)一口約0．47 hm2的大口黑鱸養(yǎng)殖池塘魚種出現(xiàn)突發(fā)性死亡，發(fā)病第1天死亡20多尾，第2天死亡1000多尾，第3天死亡8000多尾，一周后死亡率達(dá)90%以上。本研究中，從寄生蟲學(xué)、細(xì)菌學(xué)和病毒學(xué)三方面對(duì)該池塘中發(fā)病魚進(jìn)行分析，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查及分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)引起大口黑鱸魚種暴發(fā)性死亡的疾病為彈狀病毒病，其病原為彈狀病毒。

1 材料與方法

1.1 材料

研究用患病大口黑鱸魚種于2014年6月取自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場一口大口黑鱸養(yǎng)殖池塘，共采集7尾瀕臨死亡的發(fā)病魚。

2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技 (北京)有限公司，RNAiso Plus以及PrimeScript?RT reagent Kit購自寶生物工程(大連)有限公司，普通營養(yǎng)瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1．2．1 引物設(shè)計(jì) 在GenBank中檢索下載彈狀病毒的基因序列，在其保守序列中設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列如下:

上游引物P1為

5'ATAAGGGTAGTTGAGAAGAAG 3';

下游引物P2為

5'CTTCTTGTTGCTCTTCTTAAA 3'。

預(yù)擴(kuò)增片段長度為372 bp，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1．2．2 流行病學(xué)調(diào)查及臨床檢查 對(duì)發(fā)病養(yǎng)殖池塘的水溫以及發(fā)病魚的魚齡、苗種來源、傳染性、發(fā)病率和死亡率進(jìn)行調(diào)查，觀察病魚在養(yǎng)殖池中的活動(dòng)情況。取發(fā)病魚置于解剖盤中，觀察體表癥狀，然后打開腹腔，觀察內(nèi)臟組織器官病變。

1．2．3 細(xì)菌檢查 無菌條件下，使用普通培養(yǎng)皿，以平板劃線法從患病魚的肝、脾、腎等組織分離細(xì)菌，接種后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌的生長情況。

1．2．4 寄生蟲檢查 取病魚鰓絲，采用水浸片法，即取一點(diǎn)鰓絲于載玻片上，加上一滴清水，用鑷子將組織分散，加上蓋玻片，稍加壓平，再用顯微鏡觀察寄生蟲。

取病魚血液，采用涂片法，即取一滴血液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察寄生蟲。

取病魚肝臟、腎臟、肌肉和腸道組織，采用壓片法，即取少許組織于載玻片上，輕輕蓋上另一載玻片，輕壓使受檢組織壓成一透明薄片，然后在顯微鏡下觀察寄生蟲。

1．2．5 RNA的提取 分別取7尾魚樣品的肝、脾、腎組織器官，研磨后于-20℃下反復(fù)凍融3次備用。采取商業(yè)化的RNA抽提試劑RNAiso Plus，按照其說明書，抽提總RNA，用ddH2O溶解，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．6 RT-PCR檢測(cè)及序列分析 取檢測(cè)樣品的RNA模板7 μL，加入PCR反應(yīng)管中，再加入5×PrimeScript?Buffer 2 μL、PrimeScript?RT Enzyme Mix I 0．5 μL、Random 6 mers 0．5 μL，反應(yīng)總體積為10 μL，充分混勻后，置于PCR儀上，于37℃下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85℃下滅活逆轉(zhuǎn)錄5 s，得到cDNA產(chǎn)物。

采用引物 P1和 P2，PCR反應(yīng)體系 (共20 μL):2 ×Taq PCR MasterMix 10 μL，滅菌雙蒸水6 μL，cDNA 模板 3 μL，上、下游引物各 0．5 μL。PCR反應(yīng)程序:95℃下預(yù)變性5 min;95℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。于4℃下保存，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

將目的條帶純化后，通過正反兩次測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行Blast比對(duì)，從中選取部分相關(guān)序列，用ClustalX軟件分析序列同源性和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1．2．7 病理學(xué)研究 分別取患病魚肝、脾、腎組織，經(jīng)波恩氏液固定24 h，再經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%、100%的酒精脫水，用二甲苯透明、石蠟包埋切片 (5～6 μm)，再用蘇木精 -伊紅(H．E)染色，在Nikon E800顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況和流行病學(xué)

近年來，佛山地區(qū)人工養(yǎng)殖大口黑鱸苗種經(jīng)常發(fā)生一種急性死亡的疾病，死亡量大，用抗菌藥物無效，具有典型的傳染性，多從一個(gè)地區(qū)傳染到另外一個(gè)地區(qū)，同一地區(qū)也有相互傳染的特點(diǎn)。本研究中，采樣的發(fā)病池塘水溫為30℃，水質(zhì)指標(biāo)正常，養(yǎng)殖的大口黑鱸魚種開始死亡量小，之后死亡量突然增加，每天死亡近萬尾，使用各種抗生素均無明顯效果。病魚主要癥狀是爛身、爛鰭，停止攝食，瀕死魚在水面漫游，嚴(yán)重者體色發(fā)黑。解剖病魚鰓有少量出血點(diǎn)，肝臟嚴(yán)重腫大、充血，脾臟、腎臟腫大，胃腸空虛，其他組織器官無明顯變化。

2.2 細(xì)菌

取所采7尾大口黑鱸的肝臟和腎臟病料，接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，28℃下恒溫培養(yǎng)48 h，未見細(xì)菌長出。

2.3 寄生蟲

經(jīng)顯微鏡觀察，7尾大口黑鱸的鰓、血液和內(nèi)臟中均未觀察到大量寄生蟲。

2.4 PCR擴(kuò)增與序列分析

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，對(duì)7尾大口黑鱸的組織器官病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到與目的條帶大小相符的特異性片段 (圖1)。

應(yīng)用DNAstar 5．0軟件對(duì)本研究中得到的測(cè)序基因序列與GenBank中下載的彈狀病毒代表株進(jìn)行核苷酸序列同源性分析。本研究中引用的彈狀病毒參考毒株包括雜交鱧彈狀病毒 (HSHV)、鱖魚彈狀病毒 (SCRV)、黃鱔彈狀病毒 (MARV)、鯉春病毒血癥病毒 (SVCV)、狗魚彈狀病毒(PFRV)、病毒性出血性敗血癥病毒 (VHSV)、牙鲆彈狀病毒 (HRV)和傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)，MSRV為本研究中患病大口黑鱸彈狀病毒測(cè)序所得基因序列。同源性和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果見圖2。

圖1 大口黑鱸彈狀病毒的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR production of rhabdovirus in largemouth bass Micropterus salmonides

2.5 組織病理變化

經(jīng)過染色觀察，患病大口黑鱸的肝、脾、腎等主要器官均發(fā)生了不同程度的病理變化。

脾臟的血管和脾竇內(nèi)淤積大量血液;脾實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)嚴(yán)重的彌漫性壞死 (圖3-A)，壞死細(xì)胞核固縮、崩解，有的還保持原來的細(xì)胞核或細(xì)胞輪廓，細(xì)胞大量壞死導(dǎo)致脾實(shí)質(zhì)細(xì)胞稀疏，特別是淋巴細(xì)胞稀少。

腎臟的血管內(nèi)淤積大量的血液;腎間淋巴組織細(xì)胞呈現(xiàn)較嚴(yán)重的彌散性壞死 (圖3-B);多數(shù)病例腎小管上皮細(xì)胞輕度壞死，表現(xiàn)為其細(xì)胞核崩解，但細(xì)胞核、細(xì)胞輪廓仍完整。

肝臟的血管和肝竇內(nèi)淤積大量血液;肝細(xì)胞呈程度不一的空泡變性和彌散性壞死 (圖3-C)，肝細(xì)胞腫大、界限不清，肝細(xì)胞索排列紊亂;少數(shù)病例肝細(xì)胞呈散在性壞死;一半病例肝臟出現(xiàn)少量的壞死灶，壞死灶內(nèi)肝細(xì)胞崩解，周圍由增生的肉芽組織包繞。

腸的腸腔無內(nèi)容物，但結(jié)構(gòu)正常。

圖2 大口黑鱸彈狀病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of rhabdovirus in largemouth bass Micropterus salmonides

圖3 大口黑鱸脾、腎和肝組織的病理變化 (40×)Fig.3 Histopathological changes in liver，spleen and kidney in the diseased largemouth bass Micropterus salmoides(40×)

3 討論

彈狀病毒 (Rhabdovirus)是一種單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，種類較多，在自然界中分布廣泛，多數(shù)具有很強(qiáng)的致病性。本研究中，綜合病魚癥狀、流行情況、組織病理、特異性引物的PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果，判斷引起大口黑鱸魚種爛身、大量死亡的病因，是感染了彈狀病毒，彈狀病毒在其他種屬魚類中已有大量報(bào)道，但在大口黑鱸屬首次報(bào)道。

彈狀病毒為線性負(fù)鏈單鏈RNA病毒，病毒粒子大小為 (100～430)nm× (45～100)nm，形態(tài)似棒狀或子彈狀，通常具有5種主要結(jié)構(gòu)蛋白(L、G、N、P、M)。彈狀病毒科包括175種以上的成員，可感染脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物和植物［1］。魚類彈狀病毒因感染宿主廣、毒株種類多、毒力強(qiáng)，嚴(yán)重危害各種淡水和海水魚。迄今報(bào)道感染魚類的彈狀病毒已有20多種，其中危害較大的有鯉春病毒血癥病毒 (SVCV)、病毒性出血性敗血癥病毒 (VHSV)、傳染性造血器官壞死病毒 (IH-NV)、牙鲆彈狀病毒 (HRV)、鱖魚彈狀病毒(SCRV)［2-6］和雜交鱧彈狀病毒 (HSHV)［7］等。

彈狀病毒主要感染造血組織，導(dǎo)致造血器官壞死［8-9］，這與大口黑鱸彈狀病毒引起肝、脾、腎腫大或充血相一致。組織病理切片觀察顯示，患病魚發(fā)生造血器官(主要是脾臟和腎臟)的淋巴組織彌漫性壞死，壞死的細(xì)胞核固縮、崩解，切片結(jié)果與病變癥狀一致，為本研究結(jié)果提供了更加有力的證據(jù)。

通過序列分析，大口黑鱸彈狀病毒與雜交鱧彈狀病毒和鱖魚彈狀病毒為一個(gè)分支，同源性較高。廣東佛山地區(qū)也是雜交鱧和鱖魚的主要養(yǎng)殖區(qū)域，因此，大口黑鱸彈狀病毒很有可能是由雜交鱧或鱖魚傳染。

經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析，確診大口黑鱸因感染了彈狀病毒，導(dǎo)致造血功能以及免疫功能嚴(yán)重下降，引發(fā)患病魚大量死亡。本研究中報(bào)道了大口黑鱸彈狀病毒，為今后大口黑鱸養(yǎng)殖過程中疾病的預(yù)防和控制提供了理論依據(jù)，對(duì)大口黑鱸的健康養(yǎng)殖具有重要意義。

［1］殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)［M］．北京:科學(xué)出版社，1997．

［2］Padhi A，Verghese B．Molecular evolutionary and epidemiological dynamics of a highly pathogenic fish rhabdovirus，the spring viremia of carp virus(SVCV)［J］．Veterinary Microbiology，2012，156(1/2):54-63．

［3］Mortensen H F，Heuer O E，Lorenzen N，et al．Isolation of viral haemorrhagic septicaemia virus(VHSV)from wild marine fish species in the Baltic Sea，Kattegat，Skagerrak and North Sea［J］．Virus Research，1999，63(1/2):95-106．

［4］Nichol S T，Rowe J E，Winton J R．Molecular epizootiology and evolution of the glycoprotein and non-virion protein genes of infectious hematopoietic necrosis virus，a fish rhabdovirus［J］．Virus Research，1995，38(2/3):159-173．

［5］桂朗，李正秋，張奇亞．牙鲆一株彈狀病毒病原的分離與鑒定［J］．水生生物學(xué)報(bào)，2007，31(3):345-353．

［6］Tao J J，Gui J F，Zhagn Q Y，et al．Isolation and characterization of a rhabdovirus from co-infection of two viruses in mandarin fish［J］．Aquaculture，2007，262(1):1-9．

［7］曾偉偉，王慶，王英英，等．一株鱧科魚源彈狀病毒的分離及鑒定［J］．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37(9):1416-1424．

［8］Basurco B，Vende P，Monnier A F，et al．Genetic diversity and phylogenetic classification ofviralhemorrhagic septicemia virus(VHSV)［J］．Veterinary Research Communications，1995，26(5/6):460-463．

［9］Mulcahy D，Klaybor D，Batts W N．Isolation of infectious haematopoietic necrosis virus from a leech(Piscicola salmositica)and a copepod(Salmincola sp．)，ectoparasites of sockeye salmon Oncorhynchus nerka［J］．Disease of Aquatic Organisms，1990，8:29-34．