李英英，陳曦，李素一，李盼，李艷虹，宋鐵英

(1．福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002;2．福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所，福建福州350003)

大黃魚Pseudosciaena croce隸屬于硬骨魚綱Osteichthyes、鱸形目 Perciformes、石首魚科 Sciaenida、黃魚屬Pseudosciaena，有較高的營養(yǎng)和藥用價值［1］，是福建省主要經(jīng)濟(jì)魚類之一，全省年產(chǎn)量可達(dá)10萬t［2］。隨著近幾年大黃魚人工育苗技術(shù)的不斷成熟，海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚得到迅速發(fā)展。與此同時，飼料及營養(yǎng)問題已日益成為其進(jìn)一步發(fā)展的限制性因素。

在生產(chǎn)中，常常出現(xiàn)同一批大黃魚在魚苗批次、飼喂條件、生活環(huán)境等相同的情況下，個體差異明顯，部分魚苗生長速度緩慢，甚至成為“僵苗”現(xiàn)象。因此，分析大黃魚的消化和吸收特點，建立魚體營養(yǎng)狀態(tài)評價體系，可以為優(yōu)化養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)，有針對性地研制營養(yǎng)全面、易于吸收的飼料提供依據(jù)。研究表明，魚體消化系統(tǒng)中，腸道的菌群狀況、消化酶活性和組織學(xué)變化對于研究營養(yǎng)物質(zhì)代謝和魚苗營養(yǎng)狀態(tài)至關(guān)重要［3-4］。

本研究中，以上述指標(biāo)作為評價依據(jù)，分析引起大黃魚種群個體生長性狀差異的原因，旨在為進(jìn)一步對大黃魚的營養(yǎng)學(xué)研究和臨床指導(dǎo)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用大黃魚采自福州市連江縣下嶼某近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚場，所有魚取自同一個網(wǎng)箱，由同一批魚苗在相同的飼養(yǎng)條件下養(yǎng)殖300 d，所用飼料為冰鮮料。

熒光定量PCR(qPCR)所用SYBR Premix Ex Taq(Tli RnaseH Plus)試劑購自寶生物工程 (大連)有限公司，所用特異引物設(shè)計按各參考文獻(xiàn)所述設(shè)計 (表1)，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1．2．1 樣品的采集 將大黃魚按照體質(zhì)量大小分成兩組:組1，10～40 g為生長緩慢組;組2，60～100 g為生長正常組。從每組各取15尾大黃魚，保存于冰盒中帶回實驗室用于腸道主要菌群數(shù)量及消化酶活性的測定;另從每組各取5尾魚，立即取其腸道，并將腸道分成前、中、后三段，用體積分?jǐn)?shù)為4%的甲醛固定，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。

表1 所用引物序列與擴(kuò)增片段長度Tab.1 Sequences and amplified fragment length of the primer used

1．2．2 腸道主要菌群數(shù)量的熒光定量PCR測定從兩組各取8尾魚，無菌條件下連同內(nèi)容物一起將魚腸道取出，準(zhǔn)確稱取含有內(nèi)容物的腸道200 mg，冰上研磨，對所得樣品按照糞便基因組DNA提取試劑盒 (天根生化科技 (北京)有限公司)說明書方法提取DNA，以實時熒光定量PCR(qPCR)法測定腸道細(xì)菌總量及9種魚類腸道常見菌數(shù)量。

1．2．3 腸道消化酶活性的測定 從兩組各取7尾魚，無菌條件下取其腸道，稱重后連同內(nèi)容物一起冰上研磨，對所得樣品分別按照BCA法蛋白定量、淀粉酶 (AMS)、脂肪酶 (LPS)、胰蛋白酶、堿性磷酸酶 (AKP)(酶標(biāo)法)測試盒 (均為南京建成生物工程研究所)，以及魚亮氨酸氨肽酶 (LAP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒 (上海科興生物科技有限公司)說明書方法測定其腸道各種消化酶活性。

1．2．4 腸道組織形態(tài)學(xué)觀察 取用甲醛固定24 h的兩組魚前、中、后腸道，用常規(guī)方法制作石蠟切片(5 μm)，H．E染色后用中性樹膠封片，在 Motic SFC-11顯微鏡下觀察并拍照。

數(shù)據(jù)采集時每組選取5張切片，每張切片中隨機(jī)選取5根完整的絨毛，測量其杯狀細(xì)胞數(shù)量和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞數(shù)量用每100 μm絨毛中的細(xì)胞個數(shù)來表示［15］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 16．0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析 (Oneway ANOVA)，若各處理組之間差異達(dá)到顯著水平后，則進(jìn)行LSD多重比較，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩組大黃魚腸道菌群數(shù)量

以熒光定量PCR法檢測腸道細(xì)菌總量及9種魚類腸道常見菌的數(shù)量水平，結(jié)果顯示，兩組大黃魚腸道中大腸桿菌、弧菌、酵母菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群。生物統(tǒng)計分析顯示:兩組魚的酵母菌數(shù)量有顯著性差異 (P＜0．05)，其他菌均無顯著性差異 (P＞0．05);兩組大黃魚的腸球菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌和葡萄球菌4種菌群數(shù)量較少，檢測結(jié)果為陰性 (表2)。

表2 兩組大黃魚腸道的菌群數(shù)量Tab.2 Bacterial accounts in the intestine of large yellow croaker Pseudosciaena crocea in the two groups lg(cfu/g)

2.2 兩組大黃魚腸道消化酶活性

從表3可見，兩組大黃魚腸道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和堿性磷酸酶活性均無顯著性差異(P＞0．05)，亮氨酸氨肽酶含量為陰性。

表3 兩組大黃魚腸道的消化酶活性Tab.3 Activities of digestive enzymes in the intestine of large yellow croaker Pseudosciaena crocea in the two groups

2.3 兩組大黃魚腸道組織形態(tài)學(xué)

2．3．1 前腸 兩組魚前腸組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，生長緩慢的組1中，大黃魚的前腸絨毛稀疏、長度較短，且有損傷 (圖1-A1，圖1-A10)，而生長正常的組2，魚的前腸絨毛纖長、緊密、排列整齊(圖1-A2，圖1-A20)。統(tǒng)計結(jié)果表明:兩組大黃魚前腸杯狀細(xì)胞數(shù)量分別為 (2．73±0．47)、(2．14 ±0．69)cells/100 μm，且組間無顯著性差異 (P＞0．05);上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量分別為(8．07 ±1．48)、 (3．13 ±0．88)cells/100 μm，且組間有顯著性差異 (P＜0．05)。

2．3．2 中腸 組1魚的中腸絨毛稀疏且很短，僅有很少的凸起，局部絨毛消失為平坦的腸管，有的部位腸管損傷嚴(yán)重，看不到完整絨毛 (圖1-B1，圖1-B10);而組2魚的中腸絨毛排列整齊，較為緊密，且完整度好 (圖1-B2，圖1-B20)。由于組1腸道絨毛較少且損傷嚴(yán)重，該腸段上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量無法統(tǒng)計。

2．3．3 后腸 組1魚的后腸絨毛可看到大量損傷，有的樣本中絨毛甚至嚴(yán)重脫落 (圖1-C1，圖1-C10);而組2魚的后腸絨毛生長狀態(tài)良好，完整性好，數(shù)量較多，密度較大 (圖1-C2，圖1-C20)。統(tǒng)計結(jié)果表明:兩組大黃魚后腸杯狀細(xì)胞數(shù)量分別為(4．21 ±1．05)、(4．87 ±2．33)cells/100 μm，而上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量分別為(4．77±2．18)、(6．87 ±2．62)cells/100 μm，且組間均無顯著性差異 (P ＞0．05)。

圖1 大黃魚前腸、中腸和后腸的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Morphology of the foregut，midgut，and hindgut in large yellow croaker Pseudosciaena crocea under a light microscope

3 討論

3.1 兩組大黃魚腸道菌群數(shù)量的差異分析

腸道菌群的穩(wěn)定存在是動物長期進(jìn)化的結(jié)果，對機(jī)體免疫功能和營養(yǎng)吸收都有很重要的作用［16］。正常情況下，有益菌、條件致病菌和致病菌在體內(nèi)是穩(wěn)定存在的;當(dāng)餌料或者生存環(huán)境發(fā)生改變時，會出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，腸道菌群出現(xiàn)大的波動，一些致病菌或者條件致病菌大量繁殖，影響機(jī)體健康，進(jìn)而影響動物生長［17-18］。蔣長苗等［19］研究表明，患腸炎草魚的腸道厭氧菌和需氧菌比例顯著下降。本研究中，在對大黃魚腸道菌群數(shù)量的檢測時也發(fā)現(xiàn)，生長緩慢的組1魚腸道內(nèi)酵母菌和弧菌數(shù)量明顯高于生長正常的組2，兩組魚之間酵母菌數(shù)量有顯著性差異 (P＜0．05)。酵母菌屬于機(jī)會致病菌，弧菌屬于致病菌，兩者都是兼性厭氧菌［20］，組1魚腸道內(nèi)這兩種菌的數(shù)量較高，意味著與組2相比，魚腸道健康狀況較差。由于兩組魚的魚苗品質(zhì)、生長條件等都相同。由此推測，造成該組魚群生長緩慢的原因可能是在生長過程中魚群遭受了一些應(yīng)激，如飼料品質(zhì)較差、生長環(huán)境改變等，其中一些魚的免疫系統(tǒng)功能較強(qiáng)，可以很快地適應(yīng)這些應(yīng)激，而另一些魚的免疫系統(tǒng)功能較弱，應(yīng)激反應(yīng)時腸道內(nèi)一些致病菌和機(jī)會致病菌大量繁殖，影響了腸道菌群的正常平衡，進(jìn)而影響了魚腸道對食物的消化和吸收，導(dǎo)致魚群生長緩慢。

3.2 兩組大黃魚腸道消化酶活性的差異分析

食物進(jìn)入腸道后需要腸道消化酶的催化分解才能被機(jī)體吸收利用，因此，腸道消化酶活性也常被作為影響機(jī)體生長速率的指標(biāo)之一［21-22］。在檢測兩組魚的腸道消化酶活性時，亮氨酸氨肽酶活性檢測結(jié)果為陰性，可能是因為該酶主要存在于血清中，而在消化道中存在量極少;兩組魚之間淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、堿性磷酸酶4種消化酶活性均無顯著性差異 (P＞0．05)。由此推測，并不是由消化酶活性差異導(dǎo)致魚群的生長受阻。

3.3 兩組大黃魚腸道形態(tài)的差異分析

魚類對食物的消化吸收在整個腸道都有進(jìn)行［18］，一般魚類腸道可分為前、中、后三段［23］，前腸主要與消化吸收相關(guān)，中腸和后腸主要與免疫相關(guān)［24］。腸道對食物的消化吸收主要依賴于腸壁褶皺即絨毛［25］，因此，可以從腸道的絨毛狀態(tài)比較出兩組魚對食物的消化吸收能力［26］。

本研究中，通過對腸道切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)，兩組魚腸道形態(tài)差異明顯，生長正常的組2魚腸壁完整，肌層較厚，絨毛修長且完整性好;而生長緩慢的組1魚腸道肌層較薄，絨毛稀疏、較短，且有損傷，甚至在中腸僅能看到很少量的絨毛，很多部位絨毛消失，僅能看到平坦的腸腔，而且后腸腸壁嚴(yán)重?fù)p傷，大量絨毛脫落。上述結(jié)果表明，組2魚腸道收縮蠕動能力更強(qiáng)［27］，與食物的接觸面積更大，能夠更好地消化和吸收食物，對食物利用率更高。兩組魚間的顯著差異還體現(xiàn)在前腸的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞水平上，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加反映了組1魚體前腸受外來刺激時出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)比組2強(qiáng)烈［28］。由此推測，造成魚群生長緩慢的原因可能是在生長過程中如飼料品質(zhì)［28-29］、飼料形態(tài)、投喂方式、生長環(huán)境［3］等因素對魚體消化吸收系統(tǒng)造成應(yīng)激，魚體對這些應(yīng)激的適應(yīng)程度不同造成生長速度的差異。

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