郝佳，吳英茜，劉晗奇，蔡明城、3，張賽賽，李世陶，王華，王偉

(1．大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023;2．大連市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，遼寧大連116023;3．長(zhǎng)?？h水產(chǎn)技術(shù)推廣站，遼寧大連116500)

刺參Apostichopus japonicus又稱仿刺參，隸屬于棘皮動(dòng)物門 Echinodermata、海參綱 Holothuroidea、楯手目 Aspidochirota、刺參科 Stichopodidae、仿刺參屬Apostichopus，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值［1］，其蛋白質(zhì)含量高、糖類豐富且不含膽固醇，并具有滋補(bǔ)強(qiáng)身的保健功能［2］。近年來(lái)，刺參養(yǎng)殖業(yè)在中國(guó)北方地區(qū)發(fā)展迅速，在山東半島、遼寧半島的養(yǎng)殖面積日益擴(kuò)大，已經(jīng)形成一個(gè)新的海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)［3］。微生態(tài)制劑因其良好的作用及環(huán)境友好等特點(diǎn)被越來(lái)越多的應(yīng)用在刺參養(yǎng)殖過(guò)程中。

微生態(tài)制劑是從自然環(huán)境中篩選出來(lái)的微生物菌體，經(jīng)培養(yǎng)繁殖后制成含有大量有益菌的活菌制劑，它不含任何污染物和化學(xué)有害物，對(duì)改善水質(zhì)，提高養(yǎng)殖動(dòng)物成活率和相對(duì)增長(zhǎng)率，降低發(fā)病率，提升水產(chǎn)品品質(zhì)，有一定的促進(jìn)作用［4-8］。微生態(tài)制劑可分為單一菌微生態(tài)制劑和復(fù)合微生態(tài)制劑，前者是由單一菌種構(gòu)成，后者則是由多菌種混合構(gòu)成［9］。目前，用于微生態(tài)制劑的菌種較多，可用于制作海參微生態(tài)制劑的菌種有光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、芽孢桿菌、酵母菌、噬菌蛭弧菌、堿桿菌屬、黃桿菌等［10］。本研究中，以乳酸桿菌、海洋紅酵母、芽孢桿菌、光合細(xì)菌為單一菌劑和復(fù)合菌劑的主要成分，探討了其在刺參養(yǎng)殖過(guò)程中的應(yīng)用效果，以期為微生態(tài)制劑及其復(fù)合制劑在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參購(gòu)自遼寧省營(yíng)口海參育苗廠，規(guī)格為 (2．00 ±0．52)g。

4種微生態(tài)制劑購(gòu)自遼寧省大連市化工研究院，其中光合細(xì)菌和海洋紅酵母活菌濃度均為6×1010cfu/mL;枯草芽孢桿菌和乳酸菌活菌濃度均為3×1010cfu/mL。刺參餌料是由大連海洋大學(xué)科研基地提供 (配方見(jiàn)表1)。

表1 基礎(chǔ)飼料的基本組成及其營(yíng)養(yǎng)成分Tab.1 Ingredients and proximate composition of the basic diet

1.2 方法

1．2．1 不同菌種劑量配比 根據(jù)各菌種活菌濃度，同時(shí)參考廠家提供的使用濃度并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定具體的添加量，各組具體添加量見(jiàn)表2。其中，F(xiàn)組的實(shí)際添加量是根據(jù)D組中微生態(tài)制劑的原濃度，按照終濃度比為4∶1∶4∶1計(jì)算得出。

1．2．2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)在容積為200 L的水槽中進(jìn)行，每個(gè)水槽放入規(guī)格一致、健康的刺參幼參40頭，先暫養(yǎng)一周，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的養(yǎng)殖環(huán)境。正式試驗(yàn)期間，對(duì)水槽連續(xù)充氣，每2 d換水一次，吸底一次，每天投喂2次，投餌量為刺參質(zhì)量的1．5% ～2．0%，養(yǎng)殖周期為60 d。試驗(yàn)共設(shè)6組，5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，分別記為A(對(duì)照)、B、C、D、E、F組，每組設(shè)3個(gè)平行。按照菌種添加量 (表2)向各組水體中添加菌劑，換水后補(bǔ)加菌劑，即每2 d添加一次。

表2 各組微生態(tài)制劑的添加量Tab.2 Supplementation of probiotics in volume mL/m3

1．2．3 生產(chǎn)性能指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)開(kāi)始前，將選取的刺參饑餓24 h，用濾紙吸干其體表水分，稱量總質(zhì)量，除以刺參頭數(shù)測(cè)得刺參的初始體質(zhì)量;養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用同樣方法稱量刺參終末體質(zhì)量。生長(zhǎng)性能指標(biāo)的計(jì)算公式為

存活率(SR，%)=(Nt/N0)×100，

增重率(BWG，%)=(Wt-W0)/W0×100，

特定生長(zhǎng)率SGR(%/d)=(ln Wt-ln W0)/t×100。

其中:W0、Wt分別為試驗(yàn)初始和終末時(shí)刺參的平均體質(zhì)量 (g);N0和Nt分別為試驗(yàn)初始和終末時(shí)刺參的存活數(shù);t為養(yǎng)殖時(shí)間 (d)。

1．2．4 消化酶指標(biāo)測(cè)定 在養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從各組隨機(jī)選取10頭刺參，用生理鹽水沖洗干凈，剪開(kāi)刺參體壁放出體腔液，剝離出刺參腸道，然后用濾紙吸干刺參腸道水分，取0．5 g刺參腸道同一定配比的生理鹽水置于研缽中反復(fù)研磨至呈懸濁液狀態(tài)，整個(gè)過(guò)程均在冰盤上操作。將研磨好的組織液在低溫冷凍離心機(jī)上以1358 g離心15 min，取上清液備用。測(cè)定不同消化酶時(shí)，將上清液按照最適稀釋倍數(shù)稀釋后使用。

消化酶測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，根據(jù)各試劑盒使用說(shuō)明書，采用碘-淀粉比色法計(jì)算淀粉酶活力，采用比色法測(cè)定脂肪酶活力，采用福林-酚試劑法測(cè)定蛋白酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件進(jìn)行初步處理，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS 17．0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑對(duì)幼參生長(zhǎng)和存活率的影響

從表3可見(jiàn)，添加微生態(tài)制劑的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，增重率和特定增長(zhǎng)率都有所提高，對(duì)刺參幼參的存活率也有一定的促進(jìn)作用。經(jīng)單因素方差分析和Duncan多重比較顯示:除C組外，其他微生態(tài)制劑添加組的終末體質(zhì)量、增重率和特定生長(zhǎng)率較對(duì)照組均有顯著增加 (P＜0．05);其中添加復(fù)合微生態(tài)制劑的F組增重率和特定生長(zhǎng)率均高于其他微生態(tài)制劑添加組，對(duì)照組的增重率和特定生長(zhǎng)率最低;各組幼參的存活率無(wú)顯著性差異 (P＞0．05)，其中D組和F組的存活率最高，均為100%。

表3 不同微生態(tài)制劑對(duì)幼參生長(zhǎng)和存活的影響Tab.3 Effects of different probiotics on growth and survival of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 微生態(tài)制劑對(duì)幼參腸道淀粉酶活性的影響

從圖1可見(jiàn):各微生態(tài)制劑添加組的淀粉酶活性均比對(duì)照組高，其中添加復(fù)合微生態(tài)制劑的F組淀粉酶活性最高;除D組外，其他微生態(tài)制劑添加組的淀粉酶活性均較對(duì)照組顯著提高 (P＜0．05)，B、E、F組均顯著高于D組 (P＜0．05)。

圖1 不同微生態(tài)制劑對(duì)幼參腸道淀粉酶活性的影響Fig.1 Effects of different probiotics on the amylase activity in sea cucumber Apostichopus japonicus

2.3 微生態(tài)制劑對(duì)幼參腸道脂肪酶活性的影響

從圖2可見(jiàn):各微生態(tài)制劑添加組的脂肪酶活性均比對(duì)照組高，其中添加復(fù)合微生態(tài)制劑的F組脂肪酶酶活性最高;除E組外，其他微生態(tài)制劑添加組的脂肪酶活性均較對(duì)照組顯著提高 (P＜0．05)。

圖2 不同微生態(tài)制劑對(duì)幼參脂肪酶活性的影響Fig.2 Effects of different probiotics on the lipase activity in sea cucumber Apostichopus japonicus

2.4 微生態(tài)制劑對(duì)幼參腸道蛋白酶活性的影響

從圖3可見(jiàn):添加復(fù)合微生態(tài)制劑的F組蛋白酶活性最高;各微生態(tài)制劑添加組的蛋白酶活性均較對(duì)照組顯著性提高 (P＜0．05);而C、D、E、F組酶活性均顯著高于B組 (P＜0．05)。

3 討論

3.1 微生態(tài)制劑對(duì)幼參生長(zhǎng)和存活率的影響

圖3 不同微生態(tài)制劑對(duì)幼參蛋白酶活性的影響Fig.3 Effects of different probiotics on the protease activity in sea cucumber Apostichopus japonicus

微生態(tài)制劑在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用主要有兩種:一是作為水質(zhì)改良劑，二是作為水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的改良劑。作為水質(zhì)改良劑，于向陽(yáng)等［11］在養(yǎng)殖水體中添加EM菌后表明，EM菌能凈化水質(zhì)，分解海參糞便和大分子有機(jī)物，提高餌料利用率，提高單位水體育苗產(chǎn)量和成活率。而作為飼料添加劑時(shí)，華雪銘等［12］在飼料中添加0．2%的芽孢桿菌后發(fā)現(xiàn)，能顯著促進(jìn)異育銀鯽的生長(zhǎng)。與只添加芽孢桿菌不同的是，袁成玉等［13］分別向刺參基礎(chǔ)飼料中添加光合細(xì)菌、芽孢桿菌及其二者的復(fù)合菌，結(jié)果表明，試驗(yàn)組刺參的特定生長(zhǎng)率均顯著大于對(duì)照組。田維熙等［14］利用光合細(xì)菌培育中國(guó)對(duì)蝦，幼體成活率比對(duì)照組高出20%。本研究中，在水中添加微生態(tài)制劑的試驗(yàn)組與對(duì)照組成活率差異不顯著，但其特定生長(zhǎng)率卻顯著高于對(duì)照組 (P＜0．05)。說(shuō)明微生態(tài)制劑對(duì)刺參幼參的生長(zhǎng)具有良好的促進(jìn)作用。其作用機(jī)制可能是因?yàn)槲⑸鷳B(tài)制劑進(jìn)入海參體內(nèi)能刺激和促進(jìn)腸道有益微生物的增殖，調(diào)節(jié)腸道 pH，刺激腸道微生物的生長(zhǎng)和活性，提高了微生物對(duì)飼料的酶解率，從而增強(qiáng)了海參的消化機(jī)能，提高了飼料的消化率［10］。另外，有益微生物如弧菌、假單胞菌、桿狀菌和乳酸菌等，作為非機(jī)會(huì)菌能夠抑制機(jī)會(huì)菌的繁殖和生長(zhǎng)，使幼參處于健康平衡狀態(tài);在越冬階段和成體階段，也是通過(guò)調(diào)節(jié)和改善刺參腸道功能，進(jìn)而促進(jìn)刺參生長(zhǎng)的［15］。

從微生態(tài)制劑對(duì)刺參存活率的影響來(lái)看，本試驗(yàn)中6個(gè)試驗(yàn)組無(wú)顯著性差異 (表3)，但芽孢桿菌制劑組和復(fù)合微生態(tài)制劑組要略高于其他組，尤其是經(jīng)過(guò)優(yōu)化組合的復(fù)合菌，對(duì)刺參的生長(zhǎng)、存活率等都有比較明顯的促進(jìn)作用，這與郝佳等［16］的研究結(jié)果相似。而袁成玉等［13］研究結(jié)果顯示，投放微生態(tài)制劑組的成活率與對(duì)照組有顯著性差異(P＜0．05)，要高出對(duì)照組將近6個(gè)百分點(diǎn)。這與本研究結(jié)果不同。

結(jié)合生長(zhǎng)指標(biāo)分析，乳酸桿菌、海洋紅酵母、芽孢桿菌、光合細(xì)菌4種益生菌，通過(guò)有機(jī)的配合在一起，相互之間互為補(bǔ)充，一定程度上能夠起到促進(jìn)刺參生長(zhǎng)的作用。

3.2 微生態(tài)制劑對(duì)幼參消化酶活性的影響

周圍環(huán)境的改變能夠影響?zhàn)B殖動(dòng)物自身機(jī)能的適應(yīng)性，酶活力的改變就是其適應(yīng)方式中的一種［17］。在飼料中添加益生菌，能夠顯著改變養(yǎng)殖動(dòng)物淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等消化酶類的活力。研究表明，益生菌在其代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，這些生物活性物質(zhì)能有效促進(jìn)其他酶類的產(chǎn)生。如芽孢桿菌，其產(chǎn)生的酶類具有較強(qiáng)的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。有研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對(duì)對(duì)蝦腸道中蛋白酶活性有顯著影響［18］。除此之外，芽孢桿菌還具有降解飼料中復(fù)雜化合物的酶、促進(jìn)腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、提高飼料利用率的作用，芽孢桿菌可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和脂肪分解酶，這些活性消化酶可以幫助海參提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收［19］。除芽孢桿菌外，乳酸桿菌還會(huì)產(chǎn)生超氧化物歧化酶，具有提高養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力、防止毒素侵害的作用。而消化酶活力的高低直接影響動(dòng)物對(duì)飼料的利用率。有研究表明，飼料成分的改變會(huì)相應(yīng)影響動(dòng)物消化系統(tǒng)的適應(yīng)性。一般來(lái)說(shuō)，飼料中某種成分的增加，動(dòng)物機(jī)體中負(fù)責(zé)消化該成分的消化酶活力就會(huì)隨著該成分的增加而增加，同時(shí)，其他消化酶的活力也會(huì)隨之受到一定的影響［20-21］。本研究中，微生態(tài)制劑對(duì)刺參幼參消化酶活力有顯著影響，這可能是刺參消化系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)消化酶的分泌對(duì)食物中淀粉含量、蛋白質(zhì)含量和脂肪含量的增多做出的反應(yīng)。Pan等［22］在試驗(yàn)組鯉中投入芽孢桿菌制劑，并對(duì)鯉腸道蛋白酶和淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，蛋白酶和淀粉酶活性分別比對(duì)照組提高了20．5%和61．9%且差異顯著 (P＜0．05)，這與本研究結(jié)果相符。關(guān)于微生態(tài)制劑投放的方式，有研究認(rèn)為，直接投放于水體中更有利于提高脂肪酶的活性［23］。盡管本研究中沒(méi)有探討投放方式對(duì)于刺參消化酶活性的影響，但作者在其他試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，將微生態(tài)制劑添加到飼料中沒(méi)有直接投放到水體中對(duì)刺參的促生長(zhǎng)效果顯著 (另文發(fā)表)。

總之，養(yǎng)殖水體中添加微生態(tài)制劑可以提高刺參消化酶活性，提高成活率，促進(jìn)生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，將4種有益菌按照一定比例復(fù)合投放到幼參水體中相對(duì)于單個(gè)菌種投放，對(duì)刺參消化酶的活性影響更加明顯。因此，獲取最佳有益菌的配比可能將成為今后微生態(tài)制劑研究的重要方向之一。

［1］廖玉麟．我國(guó)的海參［J］．生物學(xué)通報(bào)，2001，35(9):12-15．

［2］包鵬云，丁鑒鋒，常亞青，等．糖萜素對(duì)海參生長(zhǎng)性能和消化酶活性的影響［J］．水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，2011(3):62-65．

［3］單紅云，王慶波，周影，等．EM菌在海參育苗中的應(yīng)用［J］．齊魯漁業(yè)，2007，24(7):22-24．

［4］畢永紅，王武．微生態(tài)制劑及其在集約式水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］．水產(chǎn)科技情報(bào)，2008，28(1):15-18．

［5］Janaial D E，Schwinden P，Petrus J．Rheological and physicochemical characterization of prebiotic microfilltered fermented［J］．Milk Journal of Food Engineering，2010，124(7):48-53．

［6］Li Y M，Jacobson L H，Manley H，et al．Effect of abomasal prebiotic supplementation on sheep faecal microbiota［J］．New Zealand Journal of Agricultural Research，2010，10(4):12-15．

［7］Wu M Y，Zhao S M，Kang J H，et al．Preparation and characterization of molecular weight fractions of glycosaminoglycan from sea cucumber Thelenata ananas using free radical［J］．Depolymerization Carbohydrate Research，2010，96(12):253-256．

［8］Xu D M，Zhang X L，Li M．Freeze drying of sea cucumber coated with nanoscale［J］．Silver Drying Technology，2008，15(4):78-81．

［9］Hou Q L．Role and functions of beneficial microorganisms in sustainable aquaculture［J］．Bioresource Technology，2009，100(16):24-28．

［10］鞏玉輝，陳翠翠，馬玉堃，等．微生態(tài)制劑在海參養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］．中國(guó)飼料，2012，8(5):37-39．

［11］于向陽(yáng)，宋剛．EM菌在遼西刺參育苗中的應(yīng)用［J］．農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2011，25(3):14-16．

［12］華雪銘，周洪琪，邱小珠，等．飼料中添加芽孢桿菌和硒酵母對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)及抗病力的影響［J］．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001，25(5):448-453．

［13］袁成玉，張洪，吳垠，等．微生態(tài)制劑對(duì)幼刺參生長(zhǎng)及消化酶活性的影響［J］．水產(chǎn)科學(xué)，2006，26(4):125-129．

［14］田維熙，陳俊芹，黃莉莉，等．光合細(xì)菌在對(duì)蝦養(yǎng)殖中應(yīng)用效果的研究［J］．飼料研究，1995(8):4-6．

［15］劉朝陽(yáng)，孫曉慶，范士亮．有益微生物在刺參養(yǎng)殖中的綜合應(yīng)用［J］．中國(guó)水產(chǎn)，2006，7(5):58-59．

［16］郝佳，謝喚，沈雙燁，等．不同配方EM菌對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖刺參生長(zhǎng)和存活的影響［J］．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013(11):290-293．

［17］Hassett R P，Landry M R．Seasonal changes in feeding rate，digestive enzyme activities and assimilation efficiency of Calanus pacificus［J］．Marine Ecology-Progress Series，1990，62(3):203-210．

［18］丁賢，李卓佳，陳永青，等．芽孢桿菌對(duì)凡納對(duì)蝦生長(zhǎng)和消化酶活性的影響［J］．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2004，11(6):580-584．

［19］謝鳳行，趙玉潔．幾種微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究進(jìn)展和展望［J］．天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006(4):18-21．

［20］Gangadhara B，Nandeesha M C，Varghese T J，et al．Effect of varying protein and lipid levels on the growth of rohu，Labeo rohita［J］．Asian Fish Sci，1997，10(2):139-147．

［21］楊代勤，嚴(yán)安生，陳芳，等．不同飼料對(duì)黃鱔消化酶活性的影響［J］．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2003，27(6):558-563．

［22］Pan K C，Yang H B．Progress in study of mechanism of Bacillus［J］．Feed Industry，1997，18(9):32-34．

［23］馮俊榮，陳營(yíng)，李秉鈞．微生態(tài)制劑對(duì)牙鲆幼魚脂肪酶的影響［J］．水產(chǎn)科學(xué)，2008，27(2):64-66．