賴杰仁

（九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000）

HPLC測(cè)定葛根溫膽顆粒中葛根素的含量

賴杰仁

（九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000）

目的：建立葛根溫膽顆粒中葛根素的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，Prontosil 120-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸（18∶82）；流速1.0 m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不得低于3 000。結(jié)果：葛根素對(duì)照品進(jìn)樣量在0.020 02～1.000 84μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），葛根素平均加樣回收率為97.45%，RSD為1.62%（n=6）。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。適宜用于測(cè)定葛根溫膽顆粒中葛根素的含量。

葛根溫膽顆粒；葛根素；含量測(cè)定；高效液相色譜法

葛根溫膽顆粒系九江市中醫(yī)醫(yī)院自主研發(fā)的國(guó)家重點(diǎn)?？乒遣】铺厣t(yī)院制劑，已取得醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑批準(zhǔn)文號(hào)。本品由葛根、當(dāng)歸、桂枝、丹參、紅花、威靈仙等十余味中藥組成，具有活血通絡(luò)，化痰散瘀，祛風(fēng)理氣的功效，臨床應(yīng)用于證屬痰濕阻絡(luò)及氣滯血瘀型頸椎病，安全可靠，療效顯著。基于葛根素是該復(fù)方制劑中主要的指標(biāo)性成分，本文采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定本品葛根素的含量，將葛根素的含量作為葛根溫膽顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，旨在為本制劑建立內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與藥品

高效液相色譜儀：Waters系列高效液相色譜儀，包括：Waters 600 controller,PDA2996型二極管陣列檢測(cè)器，Empower化學(xué)工作站。SHIMADZULC-2010AHT高效液相色譜儀，紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，LC-solution色譜工作站。KQ5200B型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

葛根素對(duì)照品（含量測(cè)定用，純度為 95.5%，批號(hào)：110752-201313，中國(guó)藥品生物制品檢定所），甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

葛根溫膽顆粒（批號(hào)：20131101，20131102，20131103，20131104，20131105，20131106，20131201，20131202，20131203，20131204，九江市中醫(yī)醫(yī)院研制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Prontosil120-5-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）。流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液（18∶82）；流速：1.0 m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不得低于3 000。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用PDA檢測(cè)器對(duì)葛根素對(duì)照品與樣品溶液中與葛根素對(duì)照品相應(yīng)位置上的色譜峰在400～210 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果均在250 nm波長(zhǎng)附近處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品10.48 mg，置50 m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品母液。精密移取對(duì)照品母液5 m L，用甲醇定容至50 m L容量瓶中，即得葛根素對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 裝量差異項(xiàng)下本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相50 m L，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30分鐘，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照樣品溶液的制備 除葛根以外，其余各藥材按葛根溫膽顆粒處方量制備陰性對(duì)照樣品，同供試品溶液制備方法，制得缺葛根的陰性對(duì)照樣品溶液。

2.4 方法的專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取供試品溶液、陰性對(duì)照樣品溶液與對(duì)照品溶液各 10μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示葛根素峰形良好，基線平穩(wěn)，對(duì)照品、供試品在相同時(shí)間有一色譜峰，而陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別吸取“2.3.1”項(xiàng)下葛根素對(duì)照品溶液1，5，10，20μL，對(duì)照品母液5μL，注入液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定葛根素峰面積，以進(jìn)樣量X與峰面積Y線性回歸處理，在0.020 02～1.000 84μg范圍內(nèi)葛根素進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 9），回歸方程為：

Y=4.589 84 ×106X-4.339 84×103。

n=5，見(jiàn)圖2。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下葛根素對(duì)照品溶液10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定葛根素峰面積值，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算得對(duì)照品峰面積值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.57%，測(cè)定方法的精密度良好。

圖1 葛根素色譜圖

圖2 葛根素的線性圖

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在 0，1，3，5，7，9，12，24小時(shí)，精密吸取照“2.3.2”項(xiàng)下制備的供試品（批號(hào)：20131201）溶液10μL，測(cè)定供試品溶液中葛根素峰面積值，計(jì)算供試品葛根素峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.79%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

裝量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20131201）適量，研細(xì)，取約0.5 g，共6份，精密稱定，照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，處理結(jié)果數(shù)據(jù)，平均含量為2.149 5 mg/g，RSD為1.00%，方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

裝量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20131201，葛根素含量為2.149 5mg/g），研細(xì)，取6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含葛根素 （濃度0.010 01 mg/m L）對(duì)照品的流動(dòng)相混合溶液50.00 m L，稱定質(zhì)量，照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，見(jiàn)表1。樣品中葛根素平均回收率為97.45%，RSD為 1.62%（n=6），葛根素回收率良好。

表1 葛根素回收率測(cè)定結(jié)果

2.10 耐用性試驗(yàn)

裝量差異項(xiàng)下本品（批號(hào)：20131201，20131202），研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別用A：Prontosil120-5-C18（250mm× 4.6mm，5μm)，B：Agilent Eclipse XDB-C18（250mm× 4.6 mm，5μm)，C：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）3種品牌的色譜柱，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定葛根素含量，葛根素含量的RSD低于1.0%，見(jiàn)表2。

2.11 樣品測(cè)定

表2 不同色譜柱測(cè)定葛根素含量結(jié)果

裝量差異項(xiàng)下本品10批次，研細(xì)，各取約0.5 g，精密稱定，照“2.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算葛根素含量,見(jiàn)表3。葛根素含量在1.720 5～ 2.162 5 mg/g，10批次本品葛根素平均含量為1.885 8 mg/g。根據(jù)表3測(cè)定結(jié)果，考慮藥材來(lái)源、配制操作等因素的差異影響，以平均含量的80%劃作葛根溫膽顆粒中葛根素含量的限度，即規(guī)定：本品每1 g含葛根以葛根素（C21H20O9）計(jì)，不得少于1.5 mg。

表3 葛根溫膽顆粒中葛根素含量

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中，分別比較了以甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.1%醋酸為流動(dòng)相，考察葛根溫膽顆粒中葛根素的分離情況及峰形，結(jié)果以甲醇-0.2%磷酸溶液（18∶82）為流動(dòng)相的分離情況及峰形為佳；故確定流動(dòng)相為：甲醇-0.2%磷酸溶液（18∶82）。3.2供試品溶液制備的方法考察

在供試品溶液的制備方法實(shí)驗(yàn)中，分別考察了以流動(dòng)相加熱回流提取 30 min，超聲提?。üβ?00 W，頻率25 kHz）30 m in兩種提取方式，結(jié)果顯示，這兩種提取方式對(duì)含量測(cè)定結(jié)果差異不明顯，而超聲處理較簡(jiǎn)便易行，故選用超聲處理提取方式制備供試品溶液。分別選擇了流動(dòng)相、甲醇、乙醇為提取溶劑，考察提取溶劑對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果以流動(dòng)相提取效果最好。分別超聲提取 20，30，60 m in，考察結(jié)果顯示，超聲提取30 m in即可得滿意結(jié)果。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1138-1139.

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Content Determ ination of Puerarin in Gegen W endan Granules by HPLC

Lai Jieren（Traditional Chinese Medicine Hospital of Jiujiang City，Jiangxi Jiujiang 332000，China）

Objective:To establish a HPLC method for the content determination of puerarin in gegen wendan granules.Methods:Samples were determ ined by HPLC on the C18column（250 mm ×4.6 mm，5μm）.The column temperature was at 30℃；the inject volume was 10μL.The mobile phase was consisted of methanol-0.2% phosphoric acid （18∶82）.The flow rate was 1.0 m L/min at UV detection wavelength of 250 nm.The number of theoretical plate calculated by puerarin peak should be not less than 3 000.Results:There was a good linear relationship of puerarin w ithin the range of 0.020 02～ 1.000 84μg，r=0.999 9.The average recovery of puerarin was 97.45%，RSD=1.62% （n=6）.Conclusion:The method is convenient and accurate w ith a good specificity and reproducibility， it is suitable for the content determ ination of puerarin in gegen wendan granules.

Gegen Wendan Granules；Puerarin；Determination；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.07.004

2015-04-08）

賴杰仁，男，碩士，高級(jí)工程師。研究方向：中藥新制劑與新技術(shù)。E-mail：smz_lai@163.com