于春林，張國志

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血必凈對急性胰腺炎大鼠血清一氧化氮的影響

于春林，張國志

目的 探討急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)大鼠血清一氧化氮(Nitric oxide，NO)的變化及血必凈注射液對其的影響。方法將90只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、急性胰腺炎組、血必凈組，各組再分為3、6、12 h亞組，假手術(shù)組開腹后僅行簡單的胰腺翻動，急性胰腺炎組開腹后經(jīng)十二指腸乳頭逆行膽胰管注射5%牛黃膽酸鈉建立AP模型，血必凈組在AP組基礎(chǔ)上予血必凈注射液治療，分別在各時間點采血觀察血清中淀粉酶(AMY)、一氧化氮(NO)的變化，并進(jìn)行胰腺組織病理學(xué)檢查。結(jié)果與假手術(shù)組相比，AP組中AMY、NO濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與AP組相比，血必凈組中AMY、NO濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，光鏡下AP組胰腺組織損傷明顯，而血必凈組損傷明顯改善。結(jié)論NO參與急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展過程，血必凈注射液能顯著降低血清NO，減輕胰腺組織的損傷。

急性胰腺炎;一氧化氮(NO);血必凈注射液

0 引言

急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一種病情兇險，病死率高的臨床常見急腹癥[1]。其發(fā)病機制復(fù)雜、為多種因素參與的病理生理過程，目前明確的發(fā)病機制尚未完全闡明。在急性胰腺炎發(fā)展過程中，胰腺微循環(huán)障礙是影響病情發(fā)展和預(yù)后最重要的因素，并且針對微循環(huán)的治療可以顯著降低胰腺壞死和疾病的嚴(yán)重程度[2]。而NO作為一種血管擴張因子在微循環(huán)中起重要作用[3]。目前研究證明，血必凈注射液在急性胰腺炎的治療中有顯著效果。本實驗觀察對比AP時，血清NO的動態(tài)變化及血必凈注射液對其的影響，旨在探討血必凈注射液治療AP的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠90只，體重230～270 g，由河北聯(lián)合大學(xué)實驗動物中心提供。?；悄懰徕c原料購自Sigma公司；血必凈注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；血清NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組與模型建立 將90只SD實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組、AP組、血必凈組，每組30只，各實驗組再分為3、6、12 h亞組，各10只。AP模型建立：各組大鼠術(shù)前禁食12 h不禁水，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定大鼠，按外科無菌操作開腹，取上腹正中切口長約5 cm，開腹后尋找十二指腸，用24號套管針經(jīng)腸壁從十二指腸乳頭逆行進(jìn)入膽胰管，用無創(chuàng)傷動脈夾阻斷肝門端胰膽管，套管針末端連接輸液器，以0.2 mL/min注入5%?；悄懰徕c(0.5 mL/kg)，注完后壓迫3 min，見胰腺組織水腫、出血后，去除動脈夾并關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠開腹后，僅輕輕翻動胰腺及十二指腸并關(guān)腹。血必凈組在AP模型建立成功后，予血必凈注射液(4 mL/kg)腹腔注射，每6 h注射1次。假手術(shù)組和AP組腹腔注射生理鹽水(4 mL/kg),每6 h注射1次。術(shù)后各組大鼠禁食不禁水，按預(yù)定的時間點，用24號套管針經(jīng)頸動脈插管取血3～5 mL待檢測，同時處死大鼠取胰腺組織制作病理組織切片，并按Schmidt法[4]進(jìn)行評分。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測方法 將所采血加入少許肝素，于4 ℃下3 000 r/min離心10 min，然后取2 mL上清液于-20 ℃冰箱凍存批量檢測。AMY含量用全自動生化分析儀檢測，血清NO采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，嚴(yán)格按照大鼠NO試劑盒說明書操作。胰腺組織用10%的福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 各實驗組數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，結(jié)果以表示，各組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析及t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理組織學(xué)變化 假手術(shù)組各時間點在光鏡下及肉眼下見胰腺組織無異常變化。AP組3 h肉眼可見胰腺組織充血、水腫，與周圍組織界限不清，光鏡下見胰腺小葉排列紊亂，間質(zhì)血管擴張、淤血，胰腺腺泡及脂肪組織壞死，有少量炎癥細(xì)胞浸潤及大量紅細(xì)胞滲出。AP 6 h組肉眼見胰腺組織出血、壞死明顯，鏡下見胰腺間質(zhì)血管擴張、淤血更加明顯，胰腺腺泡結(jié)構(gòu)部分消失。AP 12 h組鏡下見胰腺組織明顯壞死，腺泡結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核溶解消失，大量的炎性細(xì)胞浸潤間質(zhì)。血必凈組相比AP組各時間點，鏡下見胰腺組織充血、壞死及出血程度明顯減輕，間質(zhì)可見少量炎性細(xì)胞浸潤。按Schmidt法評分AP組隨著時間延長，胰腺組織的損害程度加劇，AP 3 h(2.6±0.8)、AP 6 h(6.3±1.4)、AP 12 h(10.4±0.6)組內(nèi)評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與假手術(shù)組各時間點評分為均(0.5±0.1)相比，AP組各時間點胰腺損傷程度加重，組間評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而血必凈組在3 h(1.6±1.1)、6 h(3.8±0.8)、12 h(9.4±0.7)與AP各時間點相比胰腺組織損傷程度均有所減輕，評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組胰腺組織病理切片見圖1。

2.2 血清淀粉酶的含量 AP組血清淀粉酶的含量隨著時間的延長而增加，3、6、12 h各組間的淀粉酶含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AP組在各時間點的含量均明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而血必凈組各時間點的血清淀粉酶含量較AP組均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組血清淀粉酶的含量見表1。

表1 三組各時間點血清淀粉酶含量比較(U/L)

2.3 血清NO的含量 與假手術(shù)組相比，AP組各時間點的血清NO均較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AP組3、6、12 h的血清NO隨時間延長而明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。血必凈組與AP組相比在各時間點血清NO的含量均較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組血清NO的含量見表2。

表2 各時間點血清NO含量的測定(μmol/L)

3 討論

目前AP的發(fā)病機制尚不清楚，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，胰腺微循環(huán)障礙是AP的啟動、持續(xù)及加劇損害的重要因素，同時胰腺微循環(huán)障礙也是水腫性胰腺炎向重癥急性胰腺炎轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素[5-6]。NO作為一種血管活性物質(zhì)在胰腺微循環(huán)障礙中起重要作用。NO是由一氧化氮合酶(NOS)通過催化L-精氨酸生成，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞。研究表明，NO具有“雙刃劍”的作用[7]，生理劑量的NO可以舒張血管平滑肌，抑制血小板聚集及一些與白細(xì)胞有關(guān)的炎癥過程，從而對機體有保護作用，但過量的NO可引起難治性的血管擴張而產(chǎn)生胰腺血流的低灌注從而加重胰腺缺血，同時，過量的NO可以直接對胰腺組織產(chǎn)生毒性作用。NO的“雙刃劍”作用體現(xiàn)了其對時間和劑量的依懶性。Liu等[8]研究了NO對雨蛙肽誘發(fā)實驗性AP大鼠演變過程中的作用，發(fā)現(xiàn)NOS抑制劑能加重AP并引起胰腺血流量下降，而NO供體能有效改善AP的病情嚴(yán)重程度，且隨著NO供體的劑量增加，改善效果越明顯，并能增強胰腺血流。由此認(rèn)為，NO能防止AP病情進(jìn)一步發(fā)展，對機體具有保護作用的機制可能是通過改善胰腺微循環(huán)障礙來實現(xiàn)。Molero等[9]發(fā)現(xiàn)，NO能降低血淀粉酶、血脂酶水平以及組織學(xué)損害，認(rèn)為NO供體藥物可以改善AP的病程。Werner等[10]研究了NO對實驗性AP的發(fā)病機制的作用，研究表明，NO可減輕胰腺組織水腫及胰腺損害。上述研究表明，NO對機體具有保護作用。但NO在AP的發(fā)展過程中也起有害作用。胡經(jīng)緯等[11]在動物實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，急性出血壞死性胰腺炎大鼠血漿NO早期明顯升高，顯著高于對照組。在AP早期，炎癥因子激活誘導(dǎo)型NOS(iNOS)從而導(dǎo)致大量NO釋放，致使微血管擴張、反饋性刺激炎癥因子釋放，減少胰腺的血流，從而加重胰腺微循環(huán)障礙，最終引起胰腺的損傷[12]。由此可知，在AP時iNOS被誘導(dǎo)激活產(chǎn)生大量NO是急性胰腺炎的致病機制之一[13]。

圖1 各組胰腺組織病理學(xué)改變

本實驗采用5%的牛磺膽酸鈉逆行胰膽管注入建立AP模型。?；悄懰徕c可引起內(nèi)皮細(xì)胞破壞，導(dǎo)致大量的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥因子浸潤在胰腺間質(zhì)[14]，而炎癥因子又可誘生和激活iNOS的活性，催化大量NO生成，高濃度的NO可導(dǎo)致微循環(huán)障礙繼而加重胰腺炎的發(fā)生發(fā)展，并損傷胰腺組織細(xì)胞。實驗結(jié)果表明，AP組大鼠血清NO的含量在各時間點均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。結(jié)合病理觀察結(jié)果示：AP組各時間點可見胰腺組織不同程度充血、水腫，與周圍組織界限不清，光鏡下見胰腺小葉排列紊亂，間質(zhì)血管擴張、淤血，胰腺腺泡及脂肪組織壞死，且有不同程度炎癥細(xì)胞浸潤及大量紅細(xì)胞滲出，胰腺腺泡不同程度的破壞甚至消失。由此推測NO參與了胰腺微循環(huán)障礙的發(fā)生發(fā)展，并對胰腺組織有內(nèi)源性損傷作用。

血必凈注射液是王今達(dá)教授以古方血府逐瘀為基礎(chǔ)精煉而出的靜脈制劑，由多種中藥合成，具有擴張血管，改善微循環(huán)與組織灌注，抑制血小板聚集，促進(jìn)纖維組織重吸收、膠原纖維的降解及保護血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用，能抑制炎性介質(zhì)的過度釋放，從而有效地減少損傷因子對機體的損傷[15-16]。本實驗結(jié)果表明，血必凈組在各時間點的血清淀粉酶及NO含量均顯著低于AP組(P<0.05)。同時，病理結(jié)果示：血必凈組在各時間點鏡下見胰腺組織充血、壞死及出血程度明顯減輕，胰腺組織結(jié)構(gòu)及腺泡結(jié)構(gòu)均有明顯改善。由此推測血必凈注射液可以降低急性胰腺炎時血清NO的含量，從而對機體產(chǎn)生保護作用。其可能機制：血必凈注射液具有活血化瘀的作用，能改善微循環(huán)，增加血流量，減少血小板的黏附和聚集，降低急性炎癥毛細(xì)血管的通透性，減少炎癥滲出，改善局部血液循環(huán)，促進(jìn)炎癥吸收，從而減少炎癥因子對誘導(dǎo)型NOS的誘生和激活，導(dǎo)致NO釋放減少，從而使血清NO的含量趨于生理劑量，而達(dá)到保護機體的作用。

總之，NO參與急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展，可以通過監(jiān)測血清NO的濃度來判斷急性胰腺炎病情的發(fā)展程度、治療效果及預(yù)后。血必凈注射液可降低血清NO，對急性胰腺炎的治療有顯著效果。

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Effect of Xuebijing injection on serum NO in rats with acute pancreatitis

YU Chun-lin,ZHANG Guo-zhi

(Department of General Surgery,Affiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan 063000,China)

Objective To investigate the change of serum NO in rats with acute pancreatitis and the effect of Xuebijing injection.MethodsNinety SD rats were randomly divided into 3 groups: sham operation group (group S),acute pancreatitis group (group AP) and Xuebijing group (group X),each group was further divided into 3 h,6 h and 12 h subgroups.In sham groups,the pancreas was flip simply after the abdomen was opened; rats in group AP received laparotomy,and they were injected with 5% sodium taurocholate through retrogradely biliopancreatic duct to establish the AP model; group X received Xuebijing injection on the basis of the treatment of AP group.The serum amylase (AMY),nitric oxide (NO) at each time point was recorded,and the pathological examination on pancreatic tissue was carried out.ResultsCompared with group S,the levels of AMY,NO in group AP were significantly higher,and there was significant difference (P<0.05); compared with group AP,the levels of AMY,NO in group X decreased significantly,there was significant difference (P<0.05).The pancreatic tissue injury in group AP was obvious under optical microscope,while the injury in group X was improved.ConclusionNO is involved in the development and progression of acute pancreatitis,Xuebijing injection can significantly reduce the serum NO,relieve the damage of pancreatic tissue.

Acute pancreatitis; Nitric oxide (NO); Xuebijing injection

2014-10-13

河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，河北 唐山 063000

10.14053/j.cnki.ppcr.201505003