李 飛，孫亞凌，成祥林，蔡光欣，蔡新宇，徐曉明，朱占勝

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天麻素調(diào)節(jié)癲疒間大鼠海馬炎癥信號(hào)通路的抗癲疒間機(jī)制研究

李 飛，孫亞凌，成祥林*，蔡光欣，蔡新宇，徐曉明，朱占勝

目的 探討天麻素調(diào)節(jié)戊四氮(PTZ)致癲疒間大鼠海馬炎癥信號(hào)通路的抗癲疒間機(jī)制。方法將40只成年Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)、癲疒間模型組(PTZ)、天麻素大劑量組(Gh)和天麻素小劑量組(Gs)，觀察四組大鼠的行為學(xué)和腦電圖的變化，應(yīng)用Western blot檢測(cè)p38MAPK蛋白表達(dá)，ELISA方法測(cè)定大鼠海馬IL-1β、IL-2、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量。結(jié)果與PTZ組相比，Gh組大鼠癲疒間發(fā)作程度、腦電圖改變、海馬p38MAPK蛋白的表達(dá)和部分炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量明顯減少(P<0.01)。結(jié)論天麻素可通過(guò)降低癲疒間大鼠海馬p38MAPK蛋白的表達(dá)、抑制部分炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的分泌，從而影響炎癥信號(hào)通路，以達(dá)到對(duì)抗癲疒間的效果。

癲疒間；戊四氮；天麻素；p38MAPK蛋白；細(xì)胞因子

0 引言

全球約有3 000萬(wàn)癲疒間患者，我國(guó)約有650萬(wàn)，每年新增100萬(wàn)左右[1]，癲疒間目前的治療仍以藥物治療為主，且主要為西藥，長(zhǎng)期服用難以堅(jiān)持，患者依從性較差，因此，必須尋找有效、低毒的治療藥物。天麻為傳統(tǒng)中藥，長(zhǎng)期作為治療癲疒間的主要藥物之一，其有效成分天麻素具有抗炎、抗氧化作用[2]，筆者臨床應(yīng)用和前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)天麻素有拮抗癲疒間的作用，但是其具體機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。本研究旨在通過(guò)觀察兩種濃度的天麻素對(duì)戊四氮(PTZ)致癲疒間大鼠行為學(xué)、腦電圖、p38MAPK蛋白表達(dá)及部分細(xì)胞因子如IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的影響，探討天麻素調(diào)節(jié)癲疒間大鼠海馬炎癥信號(hào)通路的抗癲疒間機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 戊四氮及多聚甲醛均為Sigma公司產(chǎn)品，ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，p38MAPK抗體由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，天麻素(C13H18O7)由江蘇寶澤堂醫(yī)藥科技有限公司提供(批號(hào):20100801,純度:99.2%)。

1.2 動(dòng)物

1.2.1 分組與處理 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)40只，體重280～340 g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、PTZ組(戊四氮)、Gh組(天麻素大劑量)、Gs組(天麻素小劑量)，每組10只。正常分籠飼養(yǎng)于正常晝夜環(huán)境中，正常進(jìn)食水。實(shí)驗(yàn)室安靜、通風(fēng)、空氣清潔，溫度為21～23 ℃，濕度為42%～45%。

1.2.2 動(dòng)物模型制備 NC組腹腔內(nèi)給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水10 mL/kg，1次/d，周期為10 d，周期第8、9、10天時(shí)，腹腔注射0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水45 mL/kg，1次/d；PTZ組腹腔內(nèi)給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水10 mL/kg，1次/d，周期為10 d，第8、9、10天時(shí)，每天腹腔注射戊四氮稀釋液(5 g/L)40 mL/kg[3]；Gh組腹腔內(nèi)給予天麻素200 mg/kg，1次/d，周期為10 d。第8、9、10天時(shí)，每天腹腔注射戊四氮稀釋液(5 g/L)40 mL/kg；Gs組腹腔內(nèi)給予天麻素200 mg/kg，1次/d，周期為10 d。第8、9、10天時(shí)每天腹腔注射戊四氮稀釋液(5 g/L)40 mL/kg。四組于實(shí)驗(yàn)周期第10天終止，完成注射后均觀察2 h，并記錄腦電圖。

1.2.3 腦電圖記錄 清醒狀態(tài)下將大鼠固定，采用頭皮針電極，雙極導(dǎo)聯(lián)法(額-頂)連接。電極分別取兩眼連線(xiàn)中點(diǎn)(額葉)及兩耳連線(xiàn)中點(diǎn)(頂葉)插入固定,鼻根部接地線(xiàn)。

1.2.4 行為學(xué)觀察 參照Racine癲疒間發(fā)作行為標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行觀察記錄：Ⅰ級(jí)：面肌抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)：節(jié)律性動(dòng)頭；Ⅲ級(jí)：前肢抽搐；Ⅳ級(jí)：軀干及前肢陣攣；Ⅴ級(jí)：四肢抽搐、全身陣攣。

1.2.5 標(biāo)本采集與處理 觀察1 h后，四組大鼠均行心臟灌注固定、斷頭取腦，依文獻(xiàn)[4]確定腦及海馬的部位與形態(tài)，制備海馬組織勻漿。

1.2.6 指標(biāo)測(cè)定 Western blot檢測(cè)p38MAPK表達(dá)。ELISA試劑盒：嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定標(biāo)本中大鼠海馬組織IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以表示，組間比較應(yīng)用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為變化 PTZ組大鼠給藥后，平均56 s左右出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼、節(jié)律性點(diǎn)頭、肢體抽搐等表現(xiàn)，其中7只出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作，2只出現(xiàn)Ⅳ級(jí)發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅲ級(jí)發(fā)作。Gh組大鼠給藥以后平均12 min左右出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼、節(jié)律性點(diǎn)頭、肢體抽搐等表現(xiàn)，其中1只出現(xiàn)Ⅳ級(jí)發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅲ級(jí)發(fā)作，6只出現(xiàn)Ⅱ級(jí)發(fā)作，2只出現(xiàn)Ⅰ級(jí)發(fā)作。NC組給藥前后均無(wú)明顯變化。PTZ組與Gh、Gs組比較，PTZ組與NC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 四組大鼠行為學(xué)改變比較

2.2 腦電圖變化 NC組大鼠腦電圖表現(xiàn)為α波或β波，PTZ組10只大鼠均出現(xiàn)陣發(fā)性疒間性放電，表現(xiàn)為高電位的棘波、尖波、棘-慢復(fù)合波、尖-慢復(fù)合波，Gh、Gs組部分大鼠有尖波、棘-慢復(fù)合波、尖-慢復(fù)合波出現(xiàn)，PTZ組與NC組比較，Gh、Gs組與PTZ組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Gh組與Gs組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 四組大鼠腦電圖改變比較

2.3 p38MAPK蛋白和TNF-α檢測(cè)結(jié)果 Gh、Gs、NC組大鼠海馬組織p38MAPK蛋白和TNF-α的表達(dá)均低于PTZ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 四組大鼠海馬p38MAPK蛋白表達(dá)和TNF-α測(cè)定

2.4 ELISA檢測(cè)結(jié)果 PTZ組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-2、IL-6含量高于Gh、Gs、NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 四組大鼠海馬部分白介素指標(biāo)測(cè)定(mg/L)

3 討論

癲疒間發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥機(jī)制在癲疒間的發(fā)病中占有重要的地位，許多神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞因子在其中發(fā)揮重要作用，而天麻素具有抗炎作用，并且對(duì)癲疒間具有治療作用。有研究表明，p38MAPK通路在炎癥反應(yīng)的上游起調(diào)控作用，可以磷酸化ATF2N端活化區(qū)域69、7l位的蘇氨酸，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性升高，與靶基因順式元件結(jié)合增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)包括IL-1、IL-6、TNF-α等多種炎性細(xì)胞因子在內(nèi)的基因表達(dá)[5]。同樣，本研究結(jié)果顯示，PTZ誘導(dǎo)的癲疒間大鼠p38MAPK蛋白表達(dá)增高，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活而Gh、Gs組p38MAPK表達(dá)減少，且隨著天麻素劑量增加，p38MAPK表達(dá)逐漸減少，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性保護(hù)效應(yīng)，提示p38MAPK通路參與PTZ誘導(dǎo)的癲疒間大鼠發(fā)作后的炎癥病理過(guò)程，天麻素可抑制其表達(dá)。

許多細(xì)胞因子參與了癲疒間的發(fā)病過(guò)程，其在癲疒間發(fā)病中起促進(jìn)和抑制作用，而促進(jìn)癲疒間發(fā)展的細(xì)胞因子主要有IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α，其促進(jìn)癲疒間發(fā)展的機(jī)制可能為：①抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)谷氨酰合成酶的活性；②興奮性氨基酸活性的增強(qiáng)；③刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生；④誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生其他細(xì)胞因子；⑤提高海馬錐體細(xì)胞的興奮性；⑥減弱抑制性突觸后電位，從而導(dǎo)致異常放電[6-7]。IL-2在中樞神經(jīng)中具有促進(jìn)神經(jīng)及膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，同時(shí)調(diào)節(jié)和影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞及激素的釋放分泌[8]。本研究結(jié)果顯示，PTZ組IL-lβ含量顯著高于NC組(P<0.01)，PTZ組IL-1β的異常升高為自身所致，繼而異常升高的其他細(xì)胞因子又參與了癲疒間的病理過(guò)程。另外，PTZ組IL-2、IL-6表達(dá)高于Gh、Gs、NC組(P<0.01)；Gh、Gs組IL-2、IL-6表達(dá)高于NC組(P<0.01)，但低于PTZ組；Gh組和Gs組比較不同濃度的天麻素對(duì)IL-1β、IL-2、IL-6的表達(dá)，高濃度的天麻素可減少其表達(dá)(P<0.05)。提示PTZ組中細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6參與了疾病的發(fā)病過(guò)程，與癲疒間疾病具有相關(guān)性；而與模型對(duì)照組比較，Gh組IL-1β、IL-2、IL-6值明顯降低，提示天麻素具有抗炎作用，可有效減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)腦組織，減輕腦損害。Gh組中PTZ致疒間大鼠腦電圖波幅及頻率明顯降低，也較好地佐證了上述結(jié)論。同時(shí)，PTZ組TNF-α高于Gh、Gs、NC組(P<0.01)；Gh、Gs組TNF-α表達(dá)高于NC組(P<0.01)，但低于PTZ組(P<0.01)；Gh組和Gs組比較，不同濃度的天麻素對(duì)TNF-α的表達(dá)有影響，高濃度的天麻素可減少TNF-α的表達(dá)(P<0.05)。由此推斷，天麻素有抑制癲疒間發(fā)作的作用，其機(jī)制可通過(guò)降低海馬的TNF-α活性和表達(dá)，抑制癲疒間的產(chǎn)生和發(fā)展來(lái)發(fā)揮抗癲疒間的作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以通過(guò)增加NMDA及其受體的表達(dá)，抑制GABA及其受體的表達(dá)，從而發(fā)揮抗癲疒間的作用。另外，由于p38MAPK通路在炎癥反應(yīng)的上游起著調(diào)控作用。其對(duì)IL-1β、IL-2、IL-6的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生影響。有報(bào)道，在腦組織中，TNF-α可以促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，影響癲疒間的發(fā)生發(fā)展[9]。故本實(shí)驗(yàn)中Gh、Gs組中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)減少。

綜上所述，天麻素對(duì)癲疒間的抑制作用，主要通過(guò)p38MAPK蛋白表達(dá)減少促使下游產(chǎn)物降低和其本身的抗炎作用對(duì)IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)的抑制，使IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α表達(dá)減少，從而達(dá)到抑制癲疒間的效果。但天麻素減少p38MAPK蛋白和部分炎性細(xì)胞因子的表達(dá)的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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Research on antiepileptic mechanism of gastrodin in adjusting inflammatory signal pathway on the hippocampus of epileptic rats

LI Fei,SUN Ya-ling,CHENG Xiang-lin*,CAI Guang-xin,CAI Xin-yu,XU Xiao-ming,ZHU Zhan-sheng

(The Yangtze University Clinical Medical College,The First People’s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China)

Objective To investigate the antiepileptic mechanism of gastrodin in adjusting inflammatory signal pathway on the hippocampus of pentylenetetrazol (PTZ)-induced epileptic rats.Methods40 adult Wistar rats were randomly divided into normal control group (NC),epileptic model group (PTZ),gastrodin high-dose group (Gh) and gastrodin small doses (Gs) group.The changes of behavior and EEG were observed.p38MAPK protein expression was detected by Western blot,the content of IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α in rat hippocampus were detected by ELISA method.ResultsThe levels of seizure degree,EEG changes,p38MAPK protein expression and some inflammatory cytokines IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α in hippocampus of Gh group rats were significantly lower than those of PTZ groups (P<0.01).ConclusionGastrodin can reduce p38MAPK protein expression in hippocampus of epileptic rats,inhibit the secretion of inflammatory cytokines such as IL-1β,IL-2,IL-6 and TNF-α,and achieve the antiepileptic effect.

Epilepsy; Pentylenetetrazole; Gastrodin; p38MAPK protein; Cytokines

2014-09-10

長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院，荊州 434000

湖北省衛(wèi)生廳科研一般項(xiàng)目(JX6B33)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505002

*通信作者