陳 靜，王彤，程 奇，劉顯軍(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 1108666)

白頭翁及其有效成分對(duì)仔豬免疫和抗氧化性能的影響

陳 靜，王彤，程 奇，劉顯軍
(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 1108666)

本試驗(yàn)研究了白頭翁(Pulsatillachinensis)及其有效成分——白頭翁皂苷和抗生素對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)和抗氧化參數(shù)的影響。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選用120頭、(28±2) d斷奶的仔豬，隨機(jī)分為6個(gè)處理。第1處理為對(duì)照組，喂基礎(chǔ)日糧，第2～5組在基礎(chǔ)日糧中分別添加白頭翁150和300 mg·kg-1，白頭翁皂苷12.5和25 mg·kg-1。第6組為抗生素組。試驗(yàn)期共為28 d。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，日糧中添加白頭翁和白頭翁皂苷提高了血清中干擾素-α(IFN-α)(P<0.05)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)含量(P<0.05)，提高了試驗(yàn)期第14天血清中免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量(P<0.05)和試驗(yàn)期第28天補(bǔ)體4(C4)水平(P<0.05)。白頭翁和白頭翁皂苷對(duì)血清中的免疫球蛋白(IgA)和補(bǔ)體3(C3)影響不顯著(P>0.05)。白頭翁及白頭翁皂苷均提高了試驗(yàn)期第14天的總抗氧化能力(T-AOC)，降低了試驗(yàn)期第14和28天的丙二醛含量(P<0.05)。日糧中添加白頭翁和白頭翁皂苷提高了斷奶仔豬的免疫功能和抗氧化性能，作用效果優(yōu)于抗生素，且白頭翁和白頭翁皂苷的最適添加濃度分別是300和12.5 mg·kg-1。

白頭翁；白頭翁皂苷；免疫；抗氧化；斷奶仔豬

在現(xiàn)代化畜牧養(yǎng)豬生產(chǎn)中，抗生素等添加劑過(guò)度使用造成的藥物殘留和菌種耐藥性問(wèn)題已嚴(yán)重危害人類食品安全和健康。研究表明，中草藥具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能、抗應(yīng)激、抗氧化、改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等功能，并具有低殘留、低毒等特點(diǎn)，成為抗生素替代品之一[1-3]。白頭翁是毛莨科銀蓮屬多年生草本植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，白頭翁(Pulsatillachinensis)具有清熱解毒、止痢、涼血、明目等作用[4-5]。此外，研究認(rèn)為白頭翁還具有抗腫瘤活性、殺精、治療內(nèi)毒素血癥等作用[6-7]。在仔豬生產(chǎn)中，白頭翁具有防治腹瀉的作用。20世紀(jì)60年代初，研究人員開(kāi)始對(duì)白頭翁中的化學(xué)成分進(jìn)行分析，顯示皂苷是其主要有效成分。白頭翁皂苷也具有抗炎、提高免疫力的功效[8]。

目前，國(guó)內(nèi)外在仔豬上的研究多是白頭翁復(fù)方飼料[9-10]，而單味白頭翁及其有效成分的研究?jī)H集中在對(duì)生產(chǎn)性能的影響上[11]，對(duì)白頭翁及白頭翁皂苷的免疫作用和抗氧化作用的研究較少。本研究以斷奶仔豬為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)測(cè)定仔豬血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)，比較白頭翁及白頭翁皂苷與抗生素對(duì)免疫性能的作用效果，探討白頭翁及白頭翁皂苷對(duì)斷奶仔豬的作用機(jī)理，為其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中替代抗生素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物選用(28±2) d斷奶的杜×長(zhǎng)×大(Duroc×Landrace×Yorkshire)三元雜交仔豬120頭，平均體重(7.64±0.13) kg，差異不顯著(P>0.01)。

1.2 試驗(yàn)試劑

1.2.1 白頭翁干燥根，購(gòu)自遼寧沈陽(yáng)國(guó)大天益堂大藥房。白頭翁皂苷的制備：稱取100 g干燥的白頭翁根將其充分粉碎，在索式提取器中用乙醚回流脫脂，晾干后用95%的乙醇回流、過(guò)濾。減壓濃縮后加入丙酮，用95%的熱乙醇進(jìn)行過(guò)濾，將濾液慢慢滴到丙酮-乙醚(1∶1)的混合溶劑中，有白色粉質(zhì)析出。過(guò)濾收集白色粉質(zhì)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，放在真空干燥儀上干燥，得白色粉末(即白頭翁皂苷)。提取率約為8.97%。用硅膠柱(以氯仿∶甲醇=7∶3的流動(dòng)相洗脫)分離純化上述白頭翁粗皂苷，可得到單一白頭翁皂苷[12]。

1.2.2 金霉素(商品名：歐羅肥)，雅來(lái)(煙臺(tái))動(dòng)物保健公司生產(chǎn)。硫酸粘桿菌素(商品名：抗敵素)，浙江升華拜克股份有限公司生產(chǎn)。效美素，美國(guó)禮來(lái)公司生產(chǎn)。

1.2.3 基礎(chǔ)日糧 本試驗(yàn)所用基礎(chǔ)日糧為不含抗生素的玉米-豆粕型日糧，由沈陽(yáng)愛(ài)特杰牧業(yè)有限公司生產(chǎn)。參照NRC(1998)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐配制基礎(chǔ)日糧(表1)。

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)科研種豬場(chǎng)進(jìn)行。采用半開(kāi)放式豬舍，漏縫金屬地板。試驗(yàn)豬自由采食和飲水，保持豬圈內(nèi)清潔。按照豬場(chǎng)要求進(jìn)行仔豬常規(guī)免疫及消毒。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

本試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。將120頭斷奶仔豬隨機(jī)分為6個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭仔豬。第1個(gè)處理仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧，為對(duì)照組；第2個(gè)和第3個(gè)處理飼喂基礎(chǔ)日糧+白頭翁，白頭翁添加濃度分別為150和300 mg·kg-1；第4個(gè)和第5個(gè)處理飼喂基礎(chǔ)日糧+白頭翁皂苷，白頭翁皂苷添加濃度分別為12.5 和25 mg·kg-1。第6組為抗生素組，該組仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧+金霉素100 mg·kg-1+硫酸粘桿菌素40 mg·kg-1+效美素20 mg·kg-1(表2)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定方法

1.5.1 血液的采集 試驗(yàn)開(kāi)始后的第14天和第28天清晨7：00(空腹)，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取兩頭斷奶仔豬，用一次性注射器在前腔靜脈采集血液10 mL，制備成血清，于4 ℃保存。

表1 仔豬基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Basal diet formula and nutrient levels of weaned piglets (air-dry basis)

注：① 每千克全價(jià)料含有鐵(以硫酸鐵形式)80 mg;銅(以硫酸銅形式)12 mg;鋅 (以硫酸鋅形式) 75 mg;錳10 mg;碘0.35 mg;硒0.30 mg;維生素A 1 500 IU;維生素D3 3 300 IU;維生素E 60 IU;維生素K3 6.0 mg;核黃素6.2 mg;煙酸60 mg;泛酸18.0 mg;維生素B12 0.03 mg;生物素0.46 mg。②消化能根據(jù)原料組成計(jì)算所得，其余為實(shí)測(cè)值。

Note: ① premix provided per kilogram of complete feed: Fe(as ferrous sulfate), 80 mg; Cu (as copper sulfate), 12 mg; Zn (as zinc sulfate), 75 mg; Mn, 10 mg; I, 0.35 mg; Se, 0.30 mg; VA, 1 500 IU; VD3, 3 300 IU; VE, 60 IU; VK3, 6.0 mg; riboflavin 6.2 mg; nicotinic acid 60 mg; D-pantothenic acid, 18.0 mg; VB12, 0.03 mg; biotin, 0.46 mg. ②calculated DE according to material ingredient,others were measured values.

1.5.2 指標(biāo)測(cè)定 血清指標(biāo)于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定完成。

豬白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、干擾素-α(Interferon-α，IFN-α)試劑盒購(gòu)自上海朗頓生物有限公司。IFN-α和IL-1β試劑盒利用固相夾心法酶聯(lián)免疫的吸附試驗(yàn)(ELISA)。將已知IFN-α和IL-1β濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和未知濃度的樣品加入到微孔酶標(biāo)板中進(jìn)行檢測(cè)。先把生物標(biāo)記的抗體和IFN-α、IL-1β一起進(jìn)行溫育。然后進(jìn)行洗滌，洗滌后加到親和素標(biāo)記過(guò)的HRP中。再經(jīng)過(guò)溫育洗滌，去除沒(méi)有結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A和底物B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。顏色的深淺和樣品中IFN-α和IL-1β的濃度呈線性關(guān)系。

補(bǔ)體3(Complement 3，C3)、補(bǔ)體4(Complement 4，C4)、免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM，IgM)、免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG，IgG)試劑盒購(gòu)自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司。補(bǔ)體和免疫球蛋白均采用免疫透射比濁法定量測(cè)定。樣本中的補(bǔ)體和免疫球蛋白與試劑中相應(yīng)的抗體相遇，立即形成抗原-抗體復(fù)合物，并形成一定濁度，其濁度在合適的抗體濃度存在時(shí)與抗原的含量成正比，與同樣條件下處理的校準(zhǔn)品比較，即可計(jì)算樣品中補(bǔ)體和免疫球蛋白的含量。

總抗氧化能力(Total antioxidation，T-AOC)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒購(gòu)置于南京建成生物工程研究所。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中ONE-WAY ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，多重比較用Duncan法。試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 白頭翁及白頭翁皂苷對(duì)斷奶仔豬IFN-α和IL-1β含量的影響

基礎(chǔ)日糧中添加白頭翁及白頭翁皂苷顯著地提高了斷奶仔豬血清中IFN-α的含量(P<0.05)(表3)。在試驗(yàn)期第14天，基礎(chǔ)日糧中添加150 mg·kg-1白頭翁、300 mg·kg-1白頭翁和25 mg·kg-1白頭翁皂苷組豬血清中IFN-α的含量顯著高于添加12.5 mg·kg-1白頭翁皂苷組和對(duì)照組，而添加12.5mg·kg-1白頭翁皂苷組顯著地高于對(duì)照組。在試驗(yàn)期第28天，白頭翁和白頭翁皂苷組的IFN-α的含量均顯著地高于對(duì)照組和抗生素組。其中添加12.5 mg·kg-1白頭翁皂苷組的IFN-α的含量最高。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experiment design

表3 白頭翁和白頭翁皂苷對(duì)仔豬免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effects ofPulsatillachinensisand saponin on immune indexes of weaned piglets

注：同時(shí)期同列不同小寫(xiě)字母表示相同指標(biāo)不同處理間差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note: Different lower case letters within the same column for the same test time mean significant difference among different treatments in the same parameter at 0.05 level. The same below.

在試驗(yàn)期第14天，除150 mg·kg-1白頭翁組外，其他白頭翁、白頭翁皂苷組和抗生素組豬血清中IL-1β均顯著地高于對(duì)照組(P<0.05)。在試驗(yàn)期第28天，與對(duì)照組相比，日糧中添加白頭翁、白頭翁皂苷和抗生素均顯著提高了仔豬血清IL-1β水平，其中12.5 mg·kg-1白頭翁皂苷組IL-1β的含量最高。

2.2 白頭翁及白頭翁皂苷對(duì)斷奶仔豬血清免疫球蛋白含量的影響

整個(gè)試驗(yàn)期，日糧中添加白頭翁、白頭翁皂苷和抗生素對(duì)斷奶仔豬血清中IgA的影響差異不顯著(P>0.05)(表3)。

“從與這些國(guó)際大品牌合作開(kāi)始至今，長(zhǎng)榮股份的產(chǎn)品線及產(chǎn)品結(jié)構(gòu)已經(jīng)非常完善，可以說(shuō)覆蓋了世界每一個(gè)角落，囊括了每一類客戶的需求?！辈踢B成自豪地說(shuō)道。服務(wù)國(guó)際市場(chǎng)的最大“好處”，就是促進(jìn)產(chǎn)品的改善。他坦言，這幾年長(zhǎng)榮股份在海外市場(chǎng)上的耕耘如今已到了收獲的時(shí)節(jié)，而最大的收獲便是將海外客戶的高要求轉(zhuǎn)化成為長(zhǎng)榮的競(jìng)爭(zhēng)力?！拔覀冏呦驀?guó)際獲得的不單單是業(yè)務(wù)，還有一些應(yīng)用及技術(shù)的要求，經(jīng)過(guò)我們的吸收、改進(jìn)，回過(guò)頭來(lái)又可以給國(guó)內(nèi)的客戶帶來(lái)價(jià)值的提升?！?/p>

在試驗(yàn)期第14天抗生素組的血清IgG水平最高，顯著地高于150 mg·kg-1白頭翁組和25 mg·kg-1白頭翁皂苷組(P<0.05)。在試驗(yàn)期第28天，各個(gè)處理組間IgG含量差異不顯著。

在試驗(yàn)期第14天，除150 mg·kg-1白頭翁組的IgM含量顯著地高于對(duì)照組和抗生素組(P<0.05)外，其他各處理組的IgM與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。在試驗(yàn)期第28 d時(shí)，各處理間IgM含量差異不顯著。

2.3 白頭翁及白頭翁皂苷對(duì)斷奶仔豬血清補(bǔ)體的影響

在試驗(yàn)期第14天，各處理組的C3含量差異不顯著(P>0.05)(表4)。在試驗(yàn)期第28天，添加抗生素的C3含量均顯著地高于白頭翁組和對(duì)照組(P<0.05)。

在試驗(yàn)期第14天，各處理組C4含量差異不顯著(P>0.05)。到試驗(yàn)期第28天，150 mg·kg-1白頭翁組、300 mg·kg-1白頭翁組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。皂苷組和抗生素組居中，與對(duì)照組差異不顯著。

2.4 白頭翁及白頭翁皂苷對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化性能的影響

在試驗(yàn)期第14天，日糧中添加白頭翁及白頭翁皂苷均提高了仔豬血清中T-AOC含量(表4)。25 mg·kg-1白頭翁皂苷組的T-AOC含量最高，顯著高于對(duì)照組和抗生素組(P<0.05)。其他各處理間差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)第28天，白頭翁及白頭翁皂苷對(duì)T-AOC均沒(méi)有顯著影響。

日糧中添加白頭翁(除150 mg·kg-1白頭翁組處理14 d外)、白頭翁皂苷和抗生素均降低了血清中MDA的含量。整個(gè)試驗(yàn)期，25 mg·kg-1白頭翁皂苷組的MDA含量均最低。

表4 白頭翁及白頭翁皂苷對(duì)斷奶仔豬血清補(bǔ)體和抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects ofPulsatillaschinensisand saponin on serum complement and antioxidant capacity index of weaned piglets

3 討論與結(jié)論

3.1 白頭翁和白頭翁皂苷對(duì)斷奶仔豬免疫性能的影響

機(jī)體在受到外來(lái)病原體或非病原體刺激時(shí)，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子(如IL-1、IFN-α等)，以及由刺激形成的免疫球蛋白和補(bǔ)體等抗體蛋白共同組成機(jī)體的防御系統(tǒng)。白頭翁及其成分對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能具有增強(qiáng)作用[13]。研究認(rèn)為，白頭翁對(duì)細(xì)胞因子的作用可能是因?yàn)槠鋵?duì)免疫細(xì)胞的激活作用[14]。白頭翁可以激活細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激巨噬細(xì)胞，影響白介素的分泌，但對(duì)正常狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞的分泌沒(méi)有作用。本研究中，白頭翁和白頭翁皂苷提高了斷奶應(yīng)激下仔豬血清中IL-1β、IFN-α以及免疫球蛋白和補(bǔ)體含量，提示白頭翁及白頭翁皂苷可能是通過(guò)促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，提高體內(nèi)抗體水平而增強(qiáng)斷奶仔豬免疫能力。這與陶健芳[15]的研究結(jié)果一致。

3.2 白頭翁和白頭翁皂苷對(duì)斷奶仔豬抗氧化性能影響

總抗氧化能力是反映出機(jī)體抗氧化體系對(duì)外來(lái)刺激的防御能力以及自由基代謝的狀態(tài)[16]。丙二醛是體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可反映細(xì)胞膜過(guò)氧化的程度及機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[17]。本研究結(jié)果顯示，在斷奶仔豬日糧中添加白頭翁及白頭翁皂苷可以提高血清T-AOC的含量，降低MDA的含量，說(shuō)明白頭翁及其有效成分具有較高的抗自由基氧化能力，其作用機(jī)制可能為減少外源刺激對(duì)DNA的遺傳損傷，消除自由基，中斷或終止自由基的氧化反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的總抗氧化能力[18]。本研究結(jié)果與郭愛(ài)彤和趙輝[17]報(bào)道結(jié)果相似。

3.3 抗生素對(duì)斷奶仔豬的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，抗生素的添加提高了細(xì)胞因子(IL-1β)和補(bǔ)體水平，說(shuō)明本研究所用的抗生素(金霉素、硫酸粘桿菌素和效美素)對(duì)免疫系統(tǒng)并沒(méi)有抑制作用，這與劉源等[19]研究相近。目前對(duì)于抗生素是促進(jìn)還是抑制機(jī)體的免疫機(jī)能，報(bào)道不太一致。Roura等[20]研究發(fā)現(xiàn)青霉素和鏈霉素可以顯著降低血漿中IL-1β水平，同時(shí)顯著提高了肉仔雞的體重和飼料轉(zhuǎn)化率，且抗生素促生長(zhǎng)的能力在衛(wèi)生條件差時(shí)效果較好。此外，本研究中抗生素也提高了斷奶仔豬的抗氧化性能，但抗氧化效果要低于白頭翁和白頭翁皂苷。

綜上，在斷奶仔豬日糧中添加300 mg·kg-1白頭翁和12.5 mg·kg-1白頭翁皂苷可以顯著提高斷奶仔豬的免疫性能和抗氧化性能。

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(責(zé)任編輯 張瑾)

Effects ofPulsatillachinensisand its active ingredient-saponin on immunity and antioxidation of weaned piglets

CHEN Jing, WANG Tong, CHENG Qi, LIU Xian-jun
(College of Animal husbandry and Veterinary, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The present study investigated the effect ofPulsatillachinensisand its active ingredient-saponin on immunity and antioxidation of weaned piglets. One hundred and twenty crossbred pigs with the same age (28±2 d) were randomly divided into 6 groups with different diet including basal diet as control, basal diet with 150 mg·kg-1P.chinensisas treatment 2, basal diet with 300 mg·kg-1P.chinensisas treatment 3, basal diet with 12.5 mg·kg-1saponin ofP.chinensisas treatment 4, basal diet with 25 mg·kg-1saponin ofP.chinensisas treatment 5, basal diet with antibiotics as treatment 6. The results showed pigs fed diets supplemented withP.chinensisand saponin had significant greater amount (P<0.05) of IFN-α, IL-1β, IgG and IgM in 14 d and C4 in 28 d, but had no significant effect(P>0.05) on serum IgA and C3 content compared to pigs fed the control diet. Pigs fed diets supplemented withP.chinensisand saponin had significant greater (P<0.05) serrum T-AOC in 14 d and significant lower (P<0.05) serum MDA in 14 d and 28 d compared to pigs fed the control diet. The experiment indicated thatP.chinensisand its active ingredient-saponin improved immunity and antioxidation of pigs which were superior to antibiotics. Dietary supplement of 300 mg·kg-1P.chinensisor 12.5 mg·kg-1saponin was optimal.

Pulsatillachinensis; saponin ofPulsatillachinensis; immunity; antioxidation; weaned piglets

LIU Xian-jun E-mail：lchenj@163.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0496

2014-11-14 接受日期：2015-04-24

遼寧省重大項(xiàng)目“昌圖瘦肉型豬選育及標(biāo)準(zhǔn)化健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化示范基地”(2014215031)；遼寧省重大項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗逆型豬選育技術(shù)研究與示范”(2011202005)

陳靜 (1975-)，女，遼寧北票人，講師，博士，主要從事中草藥資源開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。E-mail:chenjinglxj@163.com

劉顯軍(1972-)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與免疫調(diào)控。 E-mail：lchenj@163.com

S828

A

1001-0629(2015)07-1164-06*

陳靜，王彤，程奇，劉顯軍.白頭翁及其有效成分對(duì)仔豬免疫和抗氧化性能的影響[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(7):1164-1169.

CHEN Jing,WANG Tong,CHENG Qi,LIU Xian-jun.Effects ofPulsatillachinensisand its active ingredient-saponin on immunity and antioxidation of weaned piglets[J].Pratacultural Science，2015,32(7)：1164-1169.