吳 亮，王 曉，蘇丹華，劉 原，付 濤，姜旭淦，陳盛霞，曹建平

弓形蟲入侵的宿主細(xì)胞骨架重塑觸發(fā)線粒體重新分布

吳 亮1,2，王 曉2，蘇丹華2，劉 原2，付 濤2，姜旭淦2，陳盛霞2，曹建平1

目的 探討宿主細(xì)胞骨架重塑在弓形蟲侵入HFF細(xì)胞以及觸發(fā)細(xì)胞線粒體重新分布中的作用。方法 體外培養(yǎng)HFF細(xì)胞，預(yù)先用1 μg/mL細(xì)胞松馳素D(CD)處理30 min，接種弓形蟲速殖子分別培養(yǎng)1 h和20 h，Western blotting檢測(cè)弓形蟲表面抗原(surface antigen，SAG)1蛋白表達(dá)。同時(shí)用MitoTracker?Red CMXRos熒光探針標(biāo)記細(xì)胞線粒體，激光共聚焦顯微鏡下觀察HFF細(xì)胞線粒體在弓形蟲侵入前后和CD處理前后聚集和分布情況。結(jié)果 感染后1 h，CD處理組HFF細(xì)胞內(nèi)蟲體量與CD未處理組差異不大，20 h時(shí)CD未處理組細(xì)胞內(nèi)蟲體量顯著多于CD處理組。此時(shí)可見HFF細(xì)胞線粒體明顯聚集成明亮點(diǎn)狀且分布于納蟲泡周圍，而未感染組細(xì)胞線粒體未見明顯聚集分布。CD可以顯著抑制弓形蟲侵入HFF細(xì)胞后引起的線粒體聚集。結(jié)論 觸發(fā)宿主細(xì)胞骨架重塑是弓形蟲侵入宿主細(xì)胞并引起細(xì)胞線粒體向納蟲泡聚集所必須的。

弓形蟲；細(xì)胞骨架重塑；侵入；線粒體重新分布

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81301453), the Laboratory of Parasite and Vector Biology of China, MOPH (No. WSBKTKT201302), the Special Foundation of China Postdoctoral Science (No.2015T80518), the

China Postdoctoral Science Foundation (No.2014M561598), the Jiangsu Postdoctoral Science Foundation (No.1402171C), and the Senior Talent Studying Initial Funding of Jiangsu University (Nos.13JDG023 & 13JDG127) Corresponding authors: Chen Sheng-xia, Email: chensxia@163.com; Cao Jian-ping, Email: caojp@yahoo.com

弓形蟲是一種廣泛流行的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，可以侵入人體所有的有核細(xì)胞(包括吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞)，并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活。大量研究證實(shí)弓形蟲突破非吞噬細(xì)胞的細(xì)胞膜屏障，侵入細(xì)胞過(guò)程中伴隨著觸發(fā)宿主細(xì)胞骨架重塑(cytoskeleton rearrangement)[1]。細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中由蛋白纖維構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，包括微絲(microfilament)、微管(microtubule)和中間纖維(intemediate filament)，是構(gòu)成細(xì)胞膜以及維持細(xì)胞形態(tài)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2]。弓形蟲侵入細(xì)胞面臨的第一個(gè)障礙就是細(xì)胞膜屏障，但目前對(duì)于蟲體觸發(fā)宿主骨架重塑與突破細(xì)胞膜屏障之間的聯(lián)系并不明晰。

弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后可以誘導(dǎo)被感染細(xì)胞線粒體向蟲體周圍特異性聚集[3]。線粒體是合成能量和脂質(zhì)的重要場(chǎng)所，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)通常都含有大量線粒體，而弓形蟲速殖子僅有一個(gè)線粒體[4]。推測(cè)僅有一個(gè)線粒體似乎無(wú)法滿足蟲體在細(xì)胞內(nèi)快速增殖的能量和物質(zhì)需求，誘導(dǎo)宿主線粒體向蟲體周圍靠近，利用宿主細(xì)胞線粒體中物質(zhì)與能量就成為弓形蟲的一個(gè)必然選擇[3]。雖然現(xiàn)已證實(shí)弓形蟲的侵入伴隨著宿主細(xì)胞線粒體向蟲體周圍聚集，但對(duì)于弓形蟲觸發(fā)宿主細(xì)胞線粒體重新分布的機(jī)制目前尚不清楚。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞骨架相互交錯(cuò)構(gòu)成骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不僅是細(xì)胞器移動(dòng)的交通導(dǎo)軌，細(xì)胞骨架發(fā)生重塑時(shí)的收縮或舒張也起到牽引細(xì)胞器，幫助其移動(dòng)的作用，因此線粒體等細(xì)胞器重新分布的本質(zhì)是細(xì)胞骨架重塑進(jìn)而牽拉所造成[5]。本研究擬用細(xì)胞骨架重塑特異性抑制劑—細(xì)胞松弛素D(cytochalasin D, CD)抑制細(xì)胞骨架重塑，探討細(xì)胞骨架重塑在弓形蟲侵入、增殖和觸發(fā)細(xì)胞線粒體重新分布中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體和細(xì)胞 弓形蟲RH株速殖子由本課題組長(zhǎng)期傳代保種。人包皮成纖維(human foreskin fibroblast, HFF)細(xì)胞由本課題組自行原代培養(yǎng)[6]，選取6～20代HFF細(xì)胞用于弓形蟲速殖子體外培養(yǎng)及本實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。線粒體紅色探針MitoTracker?Red CMXRos購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，兔抗弓形蟲SAG1多克隆抗體由本課題組制備，細(xì)胞松弛素D(CD)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(HRP-IgG)和ECL發(fā)光顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，DAPI染液和抗熒光淬滅封片劑購(gòu)自南通碧云天生物有限公司，激光共聚焦顯微鏡為德國(guó)Leica公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲速殖子體外培養(yǎng) 按本課題組報(bào)道方法[7]，在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HFF細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層細(xì)胞后接種弓形蟲速殖子1×106個(gè)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h，吸棄舊培養(yǎng)液，以無(wú)菌磷酸鹽(PBS)緩沖液充分洗滌細(xì)胞，除去未進(jìn)入細(xì)胞的蟲體，添加新培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至蟲體漲破HFF細(xì)胞后，以長(zhǎng)頸滴管反復(fù)吹打瓶壁收集蟲體。蟲體經(jīng)適當(dāng)稀釋后繼續(xù)接種新HFF細(xì)胞或用于后續(xù)研究。

1.2.2 Western blotting檢測(cè)SAG1蛋白表達(dá) 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HFF細(xì)胞，待其生長(zhǎng)至單層細(xì)胞后預(yù)先以1 μg/mL CD處理30 min，接種弓形蟲RH株速殖子，每孔5×105個(gè)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h后吸棄培養(yǎng)液，以PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次，除去未粘附或侵入細(xì)胞的蟲體。用細(xì)胞刮刀刮取生長(zhǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞，連同蟲體一并以12 000×g離心收集保存于1.5 mL離心管中。另于感染20 h時(shí)以同樣方法收集細(xì)胞和蟲體。同時(shí)設(shè)未加CD對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。

于收集的蟲體中加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。分離膠濃度為15%，120 V電泳120 min，直至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到凝膠底部。恒流150 mA轉(zhuǎn)印50 min將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加抗SAG1多克隆抗體(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。加HRP-羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。吸盡膜上殘留水滴，滴加ECL液顯色并照相記錄。

1.2.3 細(xì)胞線粒體分布檢測(cè) 預(yù)先在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中放置1塊18 mm×18 mm載玻片后培養(yǎng)HFF細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層細(xì)胞后預(yù)先以1 μg/mL CD處理30 min，接種弓形蟲RH株速殖子，每孔5×105個(gè)，同時(shí)設(shè)未接種蟲體對(duì)照組和未加CD對(duì)照組。置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1 h后吸棄培養(yǎng)液，以PBS輕柔洗滌細(xì)胞2次，除去未粘附或侵入細(xì)胞的蟲體。各孔中重新添加培養(yǎng)液，并加入終濃度為200 nmol/L線粒體熒光探針，置于37 ℃染色20 min后吸棄染液，以PBS洗滌2次后加入DAPI染液，室溫下避光染色10 min，PBS洗滌2次后滴加抗熒光淬滅封片劑保存于-20 ℃。細(xì)胞和蟲體繼續(xù)培養(yǎng)至20 h時(shí)，重復(fù)上述操作。染色后標(biāo)本于激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體分布。

2 結(jié) 果

2.1 CD對(duì)弓形蟲增殖的影響 接種弓形蟲1 h，CD處理組蟲體數(shù)量與未處理組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。繼續(xù)培養(yǎng)至20 h時(shí)，未處理組蟲體數(shù)量顯著增多(P<0.05)(圖1)。

CD-: un-treaed group; CD+: treated group; *: P<0.05.圖1 弓形蟲在CD處理HFF細(xì)胞中增殖能力

Fig.1T.gondiiproliferation in HFF cell treated with cytochalasin D

2.2 弓形蟲侵入觸發(fā)HFF細(xì)胞線粒體聚集 在激光共聚焦顯微鏡下可見細(xì)胞核與蟲體細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，HFF細(xì)胞線粒體呈紅色熒光。速殖子和HFF細(xì)胞的核均不被MitoTracker?Red CMXRos著色。感染組HFF細(xì)胞內(nèi)見大量明亮紅色熒光聚集成點(diǎn)狀并圍繞于納蟲泡(parasitophorous vacuole，PV)周圍；而未感染組HFF細(xì)胞內(nèi)紅色熒光均勻地分布細(xì)胞胞漿中，且少見紅色熒光聚集成點(diǎn)狀(圖 2)。

2.3 CD對(duì)弓形蟲觸發(fā)HFF細(xì)胞線粒體聚集的影響 HFF細(xì)胞預(yù)先以1 μg/mL CD處理30 min后再接種弓形蟲共孵育20 h，在激光共聚焦顯微鏡下未見明顯的細(xì)胞內(nèi)紅色熒光聚集成點(diǎn)狀。PV周圍紅色熒光分布均勻，未聚集成點(diǎn)狀。CD未處理組HHF細(xì)胞被弓形蟲侵入后，在激光共聚焦顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)大量紅色熒光聚集成點(diǎn)狀，細(xì)胞內(nèi)PV周圍可見大量紅色點(diǎn)狀熒光(圖3)。

3 討 論

弓形蟲能夠侵入哺乳動(dòng)物非吞噬細(xì)胞和吞噬細(xì)胞[1]。非吞噬細(xì)胞不具備主動(dòng)攝取或吞噬能力，弓形蟲必須具備一套主動(dòng)侵入機(jī)制才能成功進(jìn)入非吞噬細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌都可以通過(guò)觸發(fā)宿主細(xì)胞骨架重塑，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)疏松，為細(xì)菌侵入細(xì)胞創(chuàng)造有利條件[8]。弓形蟲侵入過(guò)程中也伴隨一系列與細(xì)胞骨架重塑相關(guān)的現(xiàn)象，如線粒體等細(xì)胞器重新分布等。但目前尚無(wú)研究證實(shí)弓形蟲侵入和觸發(fā)細(xì)胞線粒體重新分布與宿主細(xì)胞骨架重塑有關(guān)。

N: HFF cell nucleus; T:T.gondiinucleus; PV: parasitophorous vacuoles; M: mitochondria

A: DAPI; B: MitoTracker?Red CMXRos

圖2 弓形蟲侵入觸發(fā)HFF細(xì)胞線粒體聚集

Fig.2 HFF mitochondria rearrangement triggering byT.gondiiinvasion

N: HFF cell nucleus; T:T.gondiinucleus; PV: parasitophorous vacuoles; M: mitochondria.

A: DAPI; B: MitoTracker?Red CMXRos

圖3 CD抑制弓形蟲觸發(fā)HFF細(xì)胞線粒體聚集

Fig.3 HFF mitochondria rearrangement suppressed by CD

細(xì)胞松馳素D(CD)常用于病原體侵入與細(xì)胞骨架重塑的研究[9]。CD通過(guò)特異性破壞細(xì)胞骨架重要成份—肌動(dòng)蛋白，從而抑制細(xì)胞骨架重塑，但對(duì)細(xì)胞內(nèi)其他成份無(wú)影響，不會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，是一種理想的細(xì)胞骨架重塑抑制劑。

弓形蟲侵入非吞噬細(xì)胞的過(guò)程復(fù)雜，可大致分為3個(gè)步驟。首先，蟲體主動(dòng)靠近并緊密地粘附于宿主細(xì)胞；其次，調(diào)控宿主細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷，蟲體通過(guò)類錐體端進(jìn)入細(xì)胞；最后，侵入處細(xì)胞膜重新封閉形成PV[10]。在PV形成的同時(shí)，宿主細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)特異性向PV靠近[3]，而細(xì)胞吞噬體則遠(yuǎn)離PV[11]。目前認(rèn)為，哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變以及細(xì)胞器分布位置變化，都是由細(xì)胞骨架重塑所引起。

本研究發(fā)現(xiàn)，感染1 h時(shí)阻斷細(xì)胞骨架重塑并未顯著的減少細(xì)胞內(nèi)蟲體數(shù)量，原因是，CD并不影響蟲體粘附于HFF細(xì)胞表面，因此通過(guò)Western blotting檢測(cè)CD處理組與未處理組細(xì)胞內(nèi)蟲體數(shù)量差異不明顯。但20 h時(shí)，阻斷細(xì)胞骨架重塑可以顯著地減少細(xì)胞內(nèi)蟲體數(shù)量，其原因在于，CD阻斷宿主細(xì)胞骨架重塑雖然不能阻止蟲體粘附于宿主細(xì)胞，但可以阻止蟲體侵入細(xì)胞，從而影響蟲體在細(xì)胞內(nèi)增殖。弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后觸發(fā)宿主線粒體重新分布并向PV聚集，但線粒體重新分布效應(yīng)被細(xì)胞骨架重塑抑制劑CD阻斷。該結(jié)果表明，弓形蟲通過(guò)觸發(fā)宿主細(xì)胞骨架重塑引起細(xì)胞線粒體重新分布，細(xì)胞骨架對(duì)蟲體侵入和宿主線粒體重新分布具有重要意義。在下一階段研究中，擬尋找弓形蟲觸發(fā)細(xì)胞骨架重塑的關(guān)鍵因子，完善弓形蟲侵入機(jī)制，為弓形蟲病的治療提供新思路。

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Cytoskeleton rearrangement and mitochondria re-distribution of host cells inToxoplasmagondiiinvasion

WU Liang1,2,WANG Xiao2,SU Dan-hua2,LIU Yuan2,FU Tao2,JIANG Xu-gan2,CHEN Sheng-xia2,CAO Jian-ping1

(1.NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Shanghai200025,China;2.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

We explored the role of host cell cytoskeleton rearrangement in mitochondria re-distribution duringToxoplasmagondiiinvasion. HFF cells were treated with cytochalasin D (CD) for 30 min, andT,gondiitachzyoites were co-cultured with HFF cells for 1 h and 20 h, respectively. After co-culture, the tachyzoite SAG1 protein was determined by Western blotting. The HFF cell mitochondria were labeled by MitoTracker Red CMXRos fluorescence probe. The HFF cell mitochondria distribution was observed by Confocal microscope inT.gondiiinfected group and CD treated group. After infection for 1 h, the number ofT.gondiitachyzoites had no significant difference between CD treated group and normal group. After infected for 20 h, the number ofT.gondiitachyzoites in normal group was much more than that in CD treated group. After 20 h’s infection, the bright point type of mitochondria gathered beside parasitophorous vacuoles (PVs) in infected group. In normal group, we did not observe the mitochondria aggregation. However, HFF cell mitochondria rearrangement triggered byT.gondiicould be suppressed by cytochalasin D. Triggering of host cell cytoskeleton rearrangement is necessary forT.gondiiproliferation and host cell mitochondria rearrangement to PVs.

Toxoplasmagondii; cytoskeleton rearrangement; invasion; mitochondria rearrangement

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81301453)，衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No.WSBKTKT201302), 中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助(No.2015T80518)，中國(guó)博士后科學(xué)基金(No.2014M561598)，江蘇省博士后科研計(jì)劃(No.1402171C)，江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金(No.13JDG024，No.13 JDG127)聯(lián)合資助

1.陳盛霞,Email：chensxia@163.com 2.曹建平，Email：caojp@yahoo.com

1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，上海 200025; 2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.003

R382

A

1002-2694(2015)11-1001-04

2015-05-20；

2015-08-23