馬藏，李涓，干小紅，周后鳳

·藥理毒理·

鼻炎通竅噴霧劑對(duì)變應(yīng)性鼻炎豚鼠血清IL-4含量和鼻黏膜Bax蛋白表達(dá)的影響

馬藏1，李涓2，干小紅1，周后鳳1

目的：通過(guò)研究鼻炎通竅噴霧劑對(duì)變應(yīng)性鼻炎（Allergic rhinitis,AR）模型豚鼠血清中白細(xì)胞介素4（Interleukin-4,IL-4）含量和鼻黏膜組織中Bax蛋白表達(dá)的影響，探討鼻炎通竅噴霧劑治療變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制。方法：用10%甲苯-2,4二異氰酸酯（10%toluene-2,4-diisocyanate ,TDI）橄欖油溶液建立豚鼠變應(yīng)性鼻炎模型；用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量測(cè)定各組豚鼠血清中IL-4的含量，免疫組化法測(cè)定鼻黏膜組織中Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組豚鼠血清的IL-4表達(dá)水平顯著低于模型對(duì)照組（p＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組豚鼠鼻黏膜中Bax蛋白的表達(dá)水平顯著高于模型對(duì)照組 (P＜0.01)。結(jié)論：鼻炎通竅噴霧劑對(duì)變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制與調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)炎細(xì)胞凋亡有關(guān)。

鼻炎通竅噴霧劑 ；變應(yīng)性鼻炎；白細(xì)胞介素4；Bax

鼻炎通竅噴霧劑是我院自行研制的純中藥制劑，臨床治療變應(yīng)性鼻炎療效確切。本研究通過(guò)建立AR豚鼠模型，觀察鼻炎通竅噴霧劑對(duì)血清中IL-4的含量和鼻粘膜中Bax陽(yáng)性表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討該藥治療AR的部分作用機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

受試藥物：鼻炎通竅噴霧劑，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，1.6 g生藥/mL，臨床擬用劑量為成人每日約1.158 g生藥。批號(hào)100601。

陽(yáng)性對(duì)照藥：曲安奈德鼻噴霧劑，6 mL/瓶，1.1 mg．mL-1，昆明源瑞制藥有限公司提供，批號(hào)：101213，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字20010190。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康豚鼠一批，雌雄各半，體重250～300 g，四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2008-14。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

甲苯-2，4二異氰酸酯(TDI) 上海試劑一廠，批號(hào)20111001；橄欖油（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)F20110202）；IL-4 Elisa試劑盒，由成

都寶信生物有限公司提供，批號(hào)為201110；自制FAA固定液；Bax一抗（Rabbit Anti-BAX），貨號(hào)BA0315，購(gòu)自博士德生物技術(shù)有限公司；Bax二抗及相應(yīng)試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

SARTORIUS電子分析天平，d=0.1～0.01 mg，德國(guó)。T-l000型電子天平，d=0.1 g，美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司；百樂(lè)550型酶標(biāo)儀；Thermo legend TR+離心機(jī)；Thermo WELLWASH 4 MK 洗板機(jī)；5-100 μL 芬蘭加樣槍；BX50光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司出品。Mias-2000圖形分析系統(tǒng)。微量加樣器，上海醫(yī)用激光儀器廠。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 造模方法 取健康豚鼠一批，雌雄各半，按性別隨機(jī)抽取10只作為正常對(duì)照組，剩余的豚鼠作為模型組用來(lái)造模。模型組動(dòng)物參照Tanaka[1]及趙秀杰[2]等關(guān)于鼻超敏反應(yīng)模型的制作方法進(jìn)行造模。模型組動(dòng)物用微量加樣器自豚鼠雙側(cè)鼻孔滴入10%TDI橄欖油溶液，每側(cè)5 μL，每日1次，連續(xù)7天。通過(guò)行為學(xué)評(píng)分判斷模型是否成功。7天后改為隔日1次（于給生理鹽水或治療藥物之后15分鐘給予橄欖油或TDI[3]），維持致敏狀態(tài)，直到藥物治療結(jié)束。正常對(duì)照組動(dòng)物同法給予橄欖油。

2.1.2 分組與給藥方法 于給造模藥的第8天從模型組抽取30只（雌雄各半）造模成功的豚鼠，按性別和體重隨機(jī)分成3組，每組10只，分別是模型對(duì)照組、鼻炎通竅噴霧劑組、曲安奈德鼻噴霧劑組。同時(shí)各組分別按照表1所示的劑量和方法給予藥物或溶劑，每天1次，連續(xù)用藥14天。

表1 鼻炎通竅噴霧劑治療AR豚鼠的給藥劑量表

2.1.3 標(biāo)本采集與測(cè)定方法 最后一次給藥后2小時(shí)，股動(dòng)脈取血5 mL，室溫下血液自然凝固15分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心20分鐘 ，收集上清液，將血清置-80℃冰箱備ELISA法測(cè)定血清中IL-4的含量，具體操作方法嚴(yán)格按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采血后處死動(dòng)物，剝離鼻周?chē)つw，包括上腭骨皮膚，沿鼻中線切開(kāi)，暴露鼻中隔與雙側(cè)鼻腔，剪下鼻中隔黏膜，用FAA液固定，做免疫組化染色，具體方法是：取鼻中隔黏膜常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。10%的正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加稀釋的一抗(稀釋倍數(shù)1:100)， 4℃過(guò)夜。PBS沖洗，5分鐘×3次。滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘×3次。DAB顯色劑顯色。自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，封片。在10×20倍光鏡下每組每只動(dòng)物都選取5個(gè)Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)視野（Bax蛋白陽(yáng)性免疫組化染色為棕黃色），運(yùn)用Mias-2000圖形分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所)對(duì)Bax蛋白在選定視野的鼻黏膜固有層中所占的面積總和比、積分光密度總和比進(jìn)行分析，定量測(cè)定Bax蛋白在鼻粘膜中的表達(dá)。

2.2 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)記錄采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S），組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)AR模型豚鼠血清IL-4的影響

結(jié)果如表2所示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組豚鼠血清IL-4含量顯著升高（p＜0.01）。與模型對(duì)照組相比，鼻炎通竅噴霧劑組豚鼠血清IL-4的含量顯著降低（p＜0.01）。

表2 鼻炎通竅噴霧劑對(duì)AR豚鼠血清IL-4含量的影響（±S）

表2 鼻炎通竅噴霧劑對(duì)AR豚鼠血清IL-4含量的影響（±S）

注：與模型對(duì)照組比較， ** p＜0.01

組別 例數(shù)（n） 血清IL-4的含量（ ng．L-1）正常對(duì)照組 10 24.07±2.96**模型對(duì)照組 10 35.24±6.05鼻炎通竅噴霧劑組 10 28.97±4.14**曲安奈德噴霧劑組 10 25.94±3.16**

3.2 對(duì)Bax蛋白的影響

結(jié)果見(jiàn)圖1-4及表3：與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組豚鼠鼻黏膜中Bax蛋白陽(yáng)性物質(zhì)面積總和比、積分光密度總和比顯著降低(P＜0.01)。與模型對(duì)照組相比，鼻炎通竅噴霧劑組豚鼠鼻黏膜中Bax蛋白陽(yáng)性物的面積總和比、積分光密度總和比顯著升高 (P＜0.01)。提示鼻炎通竅噴霧劑可以增加變應(yīng)性鼻炎模型豚鼠鼻黏膜中Bax蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)炎細(xì)胞

的凋亡。

表3 鼻炎通竅噴霧劑對(duì)AR豚鼠鼻黏膜Bax蛋白表達(dá)的影(±S)

表3 鼻炎通竅噴霧劑對(duì)AR豚鼠鼻黏膜Bax蛋白表達(dá)的影(±S)

注：與模型對(duì)照組比較，** p＜0.01

組別 例數(shù)（n） 面積﹪ 積分光密度﹪正常對(duì)照組 10 23.63±2.1**32.35±2.77**模型對(duì)照組 10 9.89±4.1 13.7±5.02鼻炎通竅噴霧劑組 10 15.19±2.62**19.89±3.3**曲安奈德噴霧劑組 10 21.94±3.26**26.39±2.22**

圖1 正常對(duì)照組Bax成強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

圖2 模型對(duì)照組Bax成微弱表達(dá)

圖3 鼻炎通竅噴霧劑組Bax成弱陽(yáng)性表達(dá)

圖4 曲安奈德噴霧劑組Bax成陽(yáng)性表達(dá)

4 討論

大量研究表明變應(yīng)性鼻炎是1型輔助性T細(xì)胞（Thl）和2型輔助性T細(xì)胞（Th2）細(xì)胞之間免疫反應(yīng)失衡，以鼻腔黏膜Th2免疫反應(yīng)為主的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，其主要的免疫病理學(xué)特征是組織中大量表達(dá)Th2細(xì)胞因子的細(xì)胞浸潤(rùn)[4～6]。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13等Th2細(xì)胞因子，參與體液免疫，引起速發(fā)型(I型)變態(tài)反應(yīng)。其中IL-4是導(dǎo)致過(guò)敏性炎癥發(fā)生的關(guān)鍵性細(xì)胞因子,它除了能使未受抗原刺激的成熟輔助性T細(xì)胞(Th0)分化為T(mén)h2外, 還促使B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，促使肥大細(xì)胞成熟脫顆粒，釋放炎性介質(zhì)。IL-4作為遲發(fā)相的始動(dòng)因素，引發(fā)Th2型細(xì)胞持續(xù)釋放IL-4，并促使炎癥細(xì)胞的聚集和活化。故IL-4在變應(yīng)性鼻炎疾病過(guò)程中起重要作用。如馮緯紜等[7]研究發(fā)現(xiàn)常年性變態(tài)反應(yīng)性鼻炎患者血清IL-4，S-IgE水平明顯高于健康組，說(shuō)明AR發(fā)作時(shí)存在著T輔助細(xì)胞亞群功能失調(diào)，通過(guò)釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)S-IgE的合成與分泌，并增加炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化，從而導(dǎo)致了I型變態(tài)反應(yīng)疾病AR的發(fā)生。袁穎等[8]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)OVA致敏模型組大鼠血清IL-4含量升高，經(jīng)鼻炎噴劑治療的大鼠其血清IL-4含量降低。表明，鼻炎噴劑治療變應(yīng)性鼻炎可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子平衡，抑制Th2類(lèi)細(xì)胞因子的分泌，從而減輕變態(tài)反應(yīng)性炎癥。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，鼻炎通竅噴霧劑能降低AR豚鼠血清中IL-4含量，提示鼻炎通竅噴霧劑具有抑制Th2細(xì)胞亞群優(yōu)勢(shì)反應(yīng)的作用，其可能的作用機(jī)制為：抑制Th2細(xì)胞的分泌功能，降低IL-4的含量，調(diào)節(jié)免疫功能，恢復(fù)Th1和Th2之間的平衡，抑制IgE的合成與分泌，減少炎性介質(zhì)的釋放，從而緩解AR的癥狀。與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

凋亡是炎細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的常見(jiàn)形式，凋亡能形成凋亡小體，被周?chē)募?xì)胞吞噬，溶酶體保持完整，酶不外溢，不會(huì)造成炎癥反應(yīng)[9]。Bax被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞凋亡最重要的調(diào)控基因。Dewson等[10]研究發(fā)現(xiàn)新鮮分離的嗜酸粒細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中有活化的Bax表達(dá)，嗜酸粒細(xì)胞凋亡過(guò)程中Bax解聚并從胞質(zhì)或胞核中移至線粒體，線粒體便釋放細(xì)胞色素C，擾亂線粒體膜電位，從而激活天冬氨酸一特異半胱氨酸蛋白激酶(caspase)，促使嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）凋亡。還有研究表明EOS凋亡增加可減少浸潤(rùn)的EOS的數(shù)量[11]。因此，能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在治療各種炎癥性疾病中有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：正常對(duì)照組豚鼠鼻黏膜中見(jiàn)較多Bax陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，表現(xiàn)為不均勻的黃褐色顆粒狀物。模型對(duì)照組豚鼠鼻中隔黏膜中胞漿表達(dá)Bax的細(xì)胞比例顯著低于正常對(duì)照組，表現(xiàn)為較淺的黃褐色顆粒狀物(P＜0.01)。與模型對(duì)照組比較，鼻炎通竅噴霧劑組鼻中隔黏膜中胞漿陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著升高(P＜0.01)。表明鼻炎通竅噴霧劑能增加鼻黏膜組織中Bax的含量，促進(jìn)炎細(xì)胞的凋亡，減輕局部炎癥侵潤(rùn)，緩解AR癥狀。

總之，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究我們可以認(rèn)為，降低血清中IL-4的含量、促進(jìn)鼻粘膜中Bax蛋白的表達(dá)，從而恢復(fù)正常的免疫功能、促進(jìn)炎細(xì)胞的凋亡、減少炎細(xì)胞侵潤(rùn)，是鼻炎通竅噴霧劑治療變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制之一。

[1] Tanaka K,Okamoto Y,Nagaya Y,et a1.S nasal allergy model developed in the Guinea pig by intranasal application of 2,4-toluene diisocyanate[J].Int Archs Allegy Appl Immunol,1998,85:392.

[2] 趙秀杰,董震,楊占泉,等.鼻超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕J].中華耳鼻咽喉科雜志,1993,28(1):17.[3] 張瓊,董倩倩,陳立峰,等.碧云噴霧劑對(duì)豚鼠TDI變應(yīng)性鼻炎的作用研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,26(3):27.

[4] AB,Kay,Allergy and allergic diseases:first of two parts[J].N Engl J Med,2001,344:30.

[5] RM,Varney VA, Jacobson MR, Sudderick.Immunohistology of the nasalmucosa following allergen-induced rhinitis. Identification of activated Tlymphocytes,eosinophils,and neutrophils[J].Am Rev Respir Dis,1992,146,170.

[6] S,Robinson DS,Hamid G,Ying Predominant TH2-1ike bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma[J]. N Engl J Med,1992,326,298.

[7] 馮緯紜,張勉,方燕飛,等.過(guò)敏性鼻炎口服液對(duì)常年性變態(tài)反應(yīng)性鼻炎S-IgE及IL-4的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2005,16(12):1232.

[8] 袁穎,郭忻. 鼻炎噴劑對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ的影響[J].江蘇中醫(yī)藥,2008,40(6):78.

[9] 來(lái)茂德主編.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 1999:76.

[10] Dewson G,Cohen GM,Wardlaw AJ.Interleukin一5 inhibits translocation of Bax to the mitochondria,cytochrome C release,and activation of caspases in human eosinophils[J]. Blood, 2001,98(7):2239.

[11] Kankaanran ta H,Lindsay M A,Giembycz M A et al. Delayed eosinophile apoptosis in asthm[J].J Allergy Clin Immunol,2000,106(1):77.

（責(zé)任編輯：陳思敏）

Effects of Biyan Tongqiao spray on the content of IL-4 in blood serum and expression of Bax in nasal mucosa of guinea pig model with allergic rhinitis/

MA Cang1,LI Juan2,GAN Xiao-hong1,ZHOU Hou-feng1//(1.Chengdu Fifth People's Hospital, Chengdu 611130, Sichuan;2.Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan)

Objective:To observe the effect of the Biyan Tongqiao spray on the content of IL-4 in blood serum and expression of Bax in nasal mucosa of guinea pig model with allergic rhinitis (AR) and explore the mechanism of Biyan Tongqiao spray in treating AR.Method:Guinea pig model with AR was established by using 10% toluene-2,4-diisocyanate olive oil solution. The content of IL-4 in blood serum was detected by ELISA method and expression of Bax in nasal mucosa was detected by immunohistochemical method.Result:The level of IL-4 in blood serum was markedly lower in the experimental group than in the model group (P＜0.01). The level of Bax protein in nasal mucosa was markedly higher in the experimental group than in the model group (P＜0.01).Conclusion:The mechanisms of Biyan Tongqiao spray in treating AR may be related to its effects of modulating immune function and promoting the apoptosis of infammatory cell.

Biyan Tongqiao spray; allergic rhinitis; IL-4; Bax

R 285.5

A

1674-926X(2015)02-017-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金

1.成都市第五人民醫(yī)院，四川 成都 611130；

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072

馬藏（1984-），女，漢族，藥師，碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究

Email:249139059@qq.com

李涓（1963-），女，漢族，主任藥師，主要從事中藥藥理及毒理學(xué)研究

Email:li062@126.com

2014-09-12