楊歡，周莉江，劉婷婷，甘彥雄，彭偉，何瑤

·藥理毒理·

四物湯揮發(fā)油的藥理作用研究

楊歡，周莉江，劉婷婷，甘彥雄，彭偉，何瑤

目的：觀察四物湯中揮發(fā)油的藥理作用及其與藥效的相關(guān)性。方法：建立小鼠痛經(jīng)模型、大鼠離體子宮平滑肌痙攣模型考察其對子宮的藥效作用；建立氯化乙酰膽堿誘導(dǎo)的小鼠胃腸痙攣模型，觀察四物湯揮發(fā)油對小鼠胃排空、腸推進(jìn)的影響；建立小鼠戊巴比妥鈉睡眠模型考察其鎮(zhèn)靜催眠作用。結(jié)果：四物湯揮發(fā)油對小鼠痛經(jīng)模型具有鎮(zhèn)痛作用，對離體子宮平滑肌的收縮具有抑制作用；對正常小鼠與胃腸痙攣模型小鼠的胃排空、腸推進(jìn)具有抑制作用；與閾下劑量的戊巴比妥鈉對小鼠催眠具有協(xié)同作用。結(jié)論：四物湯中的揮發(fā)油主要具有與其臨床應(yīng)用相關(guān)的調(diào)經(jīng)止痛作用，此外還具有抑制胃腸運動、鎮(zhèn)靜催眠的作用。

四物湯；揮發(fā)油；痛經(jīng)模型；藥理作用

湯劑是具有豐富內(nèi)涵的復(fù)雜化學(xué)體系，富含揮發(fā)性成分的湯劑實為芳香水復(fù)合制劑[1]。湯劑防病治病的基礎(chǔ)是其所含多種化學(xué)成分的總體效應(yīng)所致，其中揮發(fā)油具有多方面的生理活性?！端奈餃烦鲎杂谔瞥A道人所著《仙授理傷續(xù)斷秘方》。全方由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎組成，具有補(bǔ)血和血的功效，主治營血虛滯癥[2-4]，是婦科調(diào)經(jīng)的基本方。因其運用于婦科疾病最為廣泛，故稱譽(yù)為“婦科圣方”。四物湯中的化學(xué)成分主要有苷類、有機(jī)酸類、生物堿、多糖、揮發(fā)油、有機(jī)酸酯類及氨基酸等成分，其中揮發(fā)油是有較強(qiáng)生理活性的成分[5-8]，主要來自當(dāng)歸、川芎兩味藥材?！吨袊幍洹?010年版中“四物合劑”制法項下規(guī)定，當(dāng)歸、川芎須先經(jīng)水蒸氣蒸餾工藝提取[9]，以充分獲得及保存兩味藥

材中所含有的揮發(fā)性成分。有研究發(fā)現(xiàn)，50%乙醇滲漉工藝相對傳統(tǒng)水提方法能將四物湯中主要藥效成分較好地保留[10]。四物湯方中的揮發(fā)油類成分是四物湯的主要有效部位之一。本文通過水蒸氣蒸餾法提取四物湯中的揮發(fā)油成分對其藥理作用進(jìn)行研究，并為四物湯的臨床應(yīng)用及其新制劑開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

HW-400S恒溫平滑肌槽、BL-420E生物機(jī)能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實驗材料

熟地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.干燥塊根的炮制加工品（太極集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司，批號：1311007）；當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis (Oliv.)Diels.的干燥根（太極集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司，批號：1311008）；川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖（四川浩博藥業(yè)有限公司，批號：131201）；白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根（太極集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司，批號：1312006）。以上中藥飲片經(jīng)檢驗符合《中國藥典》(2010年版)項下標(biāo)準(zhǔn)。苯甲酸雌二醇注射液（赤峰博恩藥業(yè)有限公司，批號:120901）；縮宮素注射液（山西省芮城科龍獸藥有限公司，批號：20140101）；布洛芬混懸滴劑（上海強(qiáng)生制藥有限公司，批號：130708027）。Locke's液(每1000 mL含NaCl 9.0 g，KCl 0.42 g，CaCl20.24 g，NaHCO30.2 g，Glucose 1.0 g）為實驗室自制。硫酸阿托品注射液（杭州錢浪藥業(yè)有限公司，批號：20100501）；氯化乙酰膽堿為分析純（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號：A131230）；糊精（成都科龍化工試劑廠，批號：20110428）；活性炭為分析純（成都市科龍化工試劑廠，批號：2014062701)；戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，批號20020915）。

1.3 實驗動物

昆明種小鼠，雌雄兼用，6到8周齡，體重18～22 g；雌性SD大鼠，體重250～300 g，均由成都達(dá)碩生物科技有限公司（科技部實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(川)2012-24）提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗樣品的制備

四物湯揮發(fā)油為實驗室自制。取當(dāng)歸、川芎飲片各50 g，置于圓底燒瓶中，加900 mL水，浸泡0.5 h，加熱至沸，回流，保持微沸5 h，直到揮發(fā)油提取器中油量不再增加，停止加熱，靜置1 h，收集黃色透明油狀液體。

精密稱取四物湯揮發(fā)油，加吐溫-80置于研缽研勻，加生理鹽水高速攪拌制備O/W型乳劑，制得高、中、低劑量試驗藥液。

2.2 四物湯揮發(fā)油對小鼠痛經(jīng)模型的影響

取小鼠70只，體重18～22 g。其中雌性小鼠60只，雄性小鼠10只。雄性小鼠為陰性對照組，60只雌性小鼠隨機(jī)分為6組，分別作為空白組、模型組、陽性對照組、揮發(fā)油高、中、低劑量組。每天上午給小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.01 mg．g-1(空白組除外)，連續(xù)3 d，第2天開始，每天下午按0.02 mL．g-1灌胃給藥1次，空白組、模型組給予同體積生理鹽水，連續(xù)3d。第4天灌胃給藥前各組動物禁食不禁水12 h，第4天灌胃給藥后1 h腹腔注射縮宮素0.05 U．g-1，以扭體反應(yīng)為子宮強(qiáng)烈收縮的指標(biāo)，觀察記錄小鼠在注入縮宮素后30 min內(nèi)的扭體次數(shù)。實驗結(jié)果見表1。

表1 四物湯揮發(fā)油對小鼠痛經(jīng)模型的影響(±s，n=10)

表1 四物湯揮發(fā)油對小鼠痛經(jīng)模型的影響(±s，n=10)

注：*表示與模型組比較P＜0.05；**表示與模型組比較P＜0.01；△△表示與空白組比較P＜0.01；抑制率（%）設(shè)模型組為0%。

發(fā)生率（%）陰性對照組 / 0±0 / 0空白組 / 22.4±7.2 / 100模型組 / 31.5±5.78△△0 80陽性對照組 40 7±4.12**77.8 80低劑量組 20 8.88±3.44**71.8 80中劑量組 40 8.5±6.55**73.0 80高劑量組 80 8.6±2.61**72.7 70組別 劑量(mg．kg-1) 扭體次數(shù) 抑制率（%）

模型組與空白組比較，扭體次數(shù)增加（P＜0.01），說明造模成功。四物湯揮發(fā)油的高、中、低劑量均能明顯緩解縮宮素致小鼠子宮的激烈收縮。但四物湯揮發(fā)油高、中、低劑量組之間比較無顯著性差異，說明在達(dá)到治療劑量后，作用強(qiáng)弱與劑量無關(guān)。

2.3 四物湯揮發(fā)油對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌痙攣模型的影響

選取體重250～300g 的未孕雌性SD大鼠50只，隨機(jī)分為4組，分別作為空白組、陽性對照組、揮發(fā)油高、中、低劑量組。正式試驗前3天，每天皮下注射苯甲酸雌二醇1 mg．kg-1；第三天注射苯甲酸雌二醇1 h后，用頸椎脫臼法處死大鼠，剖腹取出子宮條（2 cm），置于盛有已預(yù)熱的Locke's液中，剝離附著于子宮的脂肪組織，陰道端結(jié)扎并固定于盛有65 mL洛氏液的小槽下端，另一端與張力換能器相連（負(fù)荷1g），恒溫水浴保持工作溫度（37±0.5℃），pH 7.3，并不斷向營養(yǎng)液中通入95%O2和5%CO2的混合氣體（每分鐘60～80個氣泡），但不得影響子宮平滑肌的舒縮活動，用BL-310生物機(jī)能實驗系統(tǒng)記錄運動曲線（儀器參數(shù)為：麥?zhǔn)显〔郏杭埶?.5 mm．min-1，靈敏度0.2 mV．cm-1，時間常數(shù)DC，濾波10 Hz）。

待子宮肌條活動穩(wěn)定，自發(fā)節(jié)律恢復(fù)后，記錄一段正常子宮收縮曲線后，加入縮宮素，使終濃度為10 U．L-1，加入縮宮素后子宮立即呈強(qiáng)直性收縮，前5 min內(nèi)平均收縮張力變化較大，但在5～30 min內(nèi)變化較為恒定，為周期性收縮。因此實驗在加入縮宮素15 min后滴加高、中、低三種劑量的四物湯揮發(fā)油藥液、陽性對照藥液5mL。觀察給藥前10 min及給藥后10 min子宮收縮張力的變化（空白組給予生理鹽水），觀察子宮舒縮曲線，計算抑制率（%）=［（給藥前曲線下面積-給藥后曲線下面積）/給藥前曲線下面積］×100%。實驗結(jié)果如表2所示。

表2 四物湯揮發(fā)油對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌痙攣的抑制作用(±s,n=10)

表2 四物湯揮發(fā)油對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌痙攣的抑制作用(±s,n=10)

注：*表示與空白組比較P＜0.05；**表示與空白組比較P＜0.01

組別 劑量（mg） 抑制率（%）空白組 / 22.75±9.47陽性對照組 10 63.42±4.32**揮發(fā)油高劑量組 20 65.05±9.05**揮發(fā)油中劑量組 10 65.95±7.43**揮發(fā)油低劑量組 5 64.38±8.57**

四物湯揮發(fā)油藥液高、中、低劑量組均能顯著減輕縮宮素致大鼠離體子宮痙攣性疼痛（P＜0.01），但作用強(qiáng)弱與劑量無明顯相關(guān)。

2.4 四物湯揮發(fā)油對正常小鼠胃排空和腸推進(jìn)的影響

取50只小鼠按體重質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只，分為空白組、陽性對照組、四物湯組、揮發(fā)油高、中、低劑量組。四物湯揮發(fā)油高、中、低劑量組分別給予四物湯揮發(fā)油高、中、低劑量乳劑灌胃0.02mL．g-1，陽性對照組灌胃硫酸阿托品0.3 mg．kg-1給藥劑量，空白組灌胃同體積生理鹽水，連續(xù)3天。末次給藥前禁食16小時，禁食期間自由飲水。末次給藥30分鐘后灌胃0.8 mL炭末糊（糊精100 g，蒸餾水130 mL，活性炭粉末10 g，混合均勻后配制成總體積為200 mL的黑色半固體糊狀物，密度為1.2 g．mL-1），灌胃活性炭糊30分鐘后脫頸處死小鼠，開腹取出全腸胃，清除胃表面的血漬，稱重（胃總重），沿大彎側(cè)剪開胃，洗去胃內(nèi)殘留物，濾紙吸干水分，再稱重（胃凈重）；兩次重量之差為胃內(nèi)殘留物重量，與灌胃炭末糊總重量做差值計算胃排空量，胃排空量與炭末糊總重量做比值，計算胃排空率。測量小腸全長與炭末前端至幽門的距離，以二者之比作為小腸的推進(jìn)率。試驗結(jié)果見表3。

表3 四物湯揮發(fā)油對正常大鼠胃排空腸推進(jìn)的影響(±s,n=10)

表3 四物湯揮發(fā)油對正常大鼠胃排空腸推進(jìn)的影響(±s,n=10)

*表示與空白組比較 p＜0.05 **表示與空白組比較 p＜0.01

組別揮發(fā)油劑量（mg．kg-1） 胃排空率 腸推進(jìn)率空白組 / 58.1±11.4 54.7±15.8陽性對照組(阿托品) / 33.7±7.1** 35.4±4.9**高劑量組 400 40.5±12.9** 39.2±6.8*中劑量組 200 43.4±6.6* 43.4±5.1*低劑量組 100 48.7±13.8 41.4±11.9*

由表3可知，與空白組比較，四物湯的揮發(fā)油高、中劑量組及陽性對照組小鼠胃排空運動減弱，四物湯揮發(fā)油低劑量組小鼠胃排空有減弱的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）；與空白對照組比較，四物湯的揮發(fā)油高、中、低劑量組及陽性對照組小鼠腸推進(jìn)減慢。

2.5 四物湯揮發(fā)油對胃腸痙攣模型小鼠胃排空和腸推進(jìn)影響

將60只小鼠按體重質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組10只，分為空白組、模型對照組、陽性對照組、揮發(fā)油高、中、低劑量組?？瞻捉M和模型對照組予等容量生理鹽水灌胃，揮發(fā)油高、中、低劑量組，陽性對照組及炭末糊的給藥方法同“2.4”，除空白組外，各組小鼠灌胃活性炭糊后立即腹腔注射氯化乙酰膽堿0.5 mg．kg-1，30分鐘后脫頸處死小鼠，檢測指標(biāo)及檢測方法同“2.4”。試驗結(jié)果見表4。

由表4可知，模型組和空白組比較，模型組的胃排空率和腸推進(jìn)率增加，說明造模成功。與模型組比較，四物湯揮發(fā)油高、中、低劑量組和陽性對照組小鼠胃排空減弱同時腸推進(jìn)減慢。

表4 四物湯揮發(fā)油對胃腸痙攣模型小鼠胃排空和腸推進(jìn)的影響(±s,n=10)

表4 四物湯揮發(fā)油對胃腸痙攣模型小鼠胃排空和腸推進(jìn)的影響(±s,n=10)

*表示與模型組比較 p＜0.05 **表示與模型組比較 p＜0.01

組別劑量（mg．kg-1）胃排空率 腸推進(jìn)率空白組 / 58±11.4 54.7±15.8模型組 / 82.3±3.3 73.5±5.5陽性對照組(阿托品) 10 36.7±4.9**39.7±7.2**揮發(fā)油高劑量組 400 49.3±8.7**46.9±6.9**揮發(fā)油中劑量組 200 58.1±12.5**50.5±18.3**揮發(fā)油低劑量組 100 73.0±11.8*56.1±14.2**

2.6 四物湯揮發(fā)油對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間影響

將50只小鼠按體重質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只，分為空白組、揮發(fā)油高、中、低劑量組。揮發(fā)油高、中、低劑量組每日給小鼠灌胃揮發(fā)油乳劑0.02 mL．g-1，四物湯組按四物湯成人每日給藥劑量折算為小鼠給藥劑量12 g．kg-1給藥，空白組灌胃同體積生理鹽水。連續(xù)給藥3 d，第三日給藥前禁食不禁水20 h，給藥后30 min腹腔注射閾下劑量25 mg．kg-1戊巴比妥鈉。觀察各組實驗動物的入睡率，以翻正反射消失1 min以上為入睡，從翻正反射消失至恢復(fù)翻正反射時間為睡眠持續(xù)時間，記錄每只小鼠睡眠時間。

表5 四物湯揮發(fā)油對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時間影響

試驗結(jié)果見表5，由表5可知，與空白組比較，揮發(fā)油高劑量組入睡時間縮短，揮發(fā)油中、低劑量組的入睡時間有縮短的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。與空白組比較，揮發(fā)油高、中、低劑量組的睡眠持續(xù)時間延長。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“不通則痛”，痛經(jīng)的根本病理機(jī)制是“氣血不通”，寒、濕、熱阻滯致氣血運行不通；氣血虛弱，不能榮養(yǎng)經(jīng)脈致氣血運行不通。動物痛經(jīng)病理模型的制備以己烯雌酚或苯甲酸雌二醇增敏、縮宮素或前列腺素致痛較為常見，該模型易操作、穩(wěn)定可靠，且藥物作用后扭體次數(shù)有較好的負(fù)相關(guān)性。離體子宮平滑肌痙攣模型，具有時間短，易于操作等優(yōu)點，實驗現(xiàn)象明顯，并且最大限度地減少了神經(jīng)和體液對子宮收縮的影響，實驗結(jié)果準(zhǔn)確度高。本試驗結(jié)果表明，四物湯中的揮發(fā)油對小鼠痛經(jīng)模型具有鎮(zhèn)痛作用，對離體子宮平滑肌的收縮具有抑制效應(yīng)。從整體動物模型和離體動物模型兩方面對四物湯中揮發(fā)油的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了評價，證明了四物湯揮發(fā)油與四物湯的功效具有較大相關(guān)性。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，生理狀態(tài)下，胃腸道平滑肌的運動受自主神經(jīng)壁內(nèi)神經(jīng)叢的支配，也與胃腸道激素、局部體液因素如組胺、前列腺素等有關(guān)[11]。通過胃排空和腸推進(jìn)試驗研究發(fā)現(xiàn)，四物湯揮發(fā)油能延緩正常實驗動物胃排空、腸推進(jìn)，也能明顯解除胃腸道興奮劑氯化乙酰膽堿誘發(fā)的小鼠胃腸平滑肌痙攣，具有抑制胃腸運動的作用；推測四物湯揮發(fā)油作用胃腸平滑肌的機(jī)制可能與其對抗膽堿能神經(jīng)對胃腸道運動支配有關(guān)，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

四物湯揮發(fā)油對小鼠睡眠時間影響試驗研究結(jié)果表明：四物湯揮發(fā)油與閾下劑量的戊巴比妥鈉對小鼠催眠具有協(xié)同作用，使戊巴比妥鈉引起的小鼠睡眠時間延長，對小鼠具有鎮(zhèn)靜催眠的作用。

四物湯揮發(fā)油是四物湯主要有效部位之一，四物湯現(xiàn)代制劑中保留揮發(fā)性成分是科學(xué)正確的，其不僅具有與四物湯功效主治相關(guān)的藥理作用，同時還具有四物湯傳統(tǒng)功效以外的藥理作用，本研究為四物湯的臨床應(yīng)用及四物湯現(xiàn)代制劑研發(fā)提供了參考和依據(jù)。

[1] 張兆旺.中藥藥劑學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:174.

[2] 鄧中甲.方劑學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2008:139.

[3] 范欣生,陳菲,劉培.等.四物湯類方養(yǎng)血調(diào)經(jīng)配伍功效探析[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2013,15(2):177.

[4] 高月,馬增春,梁乾德,等.四物湯的方證結(jié)合研究[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2010,12(2):211.

[5] 梁明金,賀浪沖.“四物湯”中當(dāng)歸有效部位及有效成分的研究[J].分析化學(xué),2004,32(1):83.

[6] 盛或欣,果德安.四物湯共煎液與單煎混合液主要成分的含量比較[J].藥物分析雜志,2005,25(1):1.

[7] 袁久榮,李以鳳,袁浩.四物湯的實驗研究[J].中國中藥雜志, 1991,16(3):153.

[8] 宿樹蘭,段金廒,趙新慧,等.四物湯及衍化方香附四物湯揮發(fā)性成分與子宮平滑肌收縮效應(yīng)相關(guān)性分析[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2008,10(2)50.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:649.

[10] 何瑤.四物湯提取工藝譜效學(xué)研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,2010:61.

[11] 戴媛媛,劉保林,竇昌貴. 吳茱萸氯仿提取物對胃排空的影響[J].中藥藥理與臨床,2003,19(3):16.

（責(zé)任編輯：蔣淼）

Pharmacological effect research of the volatile oil in Siwu Decoction/

YANG Huan, GAN Yan-xiong, PENG Wei, ZHOU Li-jiang, Liu Ting-ting, HE Yao/ / (Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; Key laboratory of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province—Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To observe the pharmacological effect of volatile oil in Siwu Decoction, and research the pharmacology effect relation between volatile oil and Siwu Decoction.Method:Mice dysmenorrhea model and rat in vitro uterine smooth muscle model were used to investigate the pharmaceutical effect. Gastrointestinal spasm mice model was established using acetylcholine chloride. The gastric emptying and intestinal propulsive motility in normal mice and gastrointestinal spasm mice were observed. Sedative and hypnotic effects were investigated in pentobarbital sodium hypnosis mice.Result:Volatile oil in Siwu Decoction eased pain in mice model and inhibited uterine smooth muscle convulsion. Volatile oil also inhibited gastric emptying and intestinal propulsion in normal mice and gastrointestinal spasm mice. Volatile oil showed synergistic effect with pentobarbital sodium of under threshold dose, and signifcantly prolonged the sleeping time of mice.Conclusion:The volatile oil in Siwu decoction has the menstruation regulating and pain relieving effects which are correlated to the pharmacology effect of Siwu decoction. In addition, volatile oil can inhibit gastrointestinal motility and show sedative and hypnotic effects .

Siwu Decoction; volatile oil; dysmenorrhea model; pharmacological effect

R 285.5

A

1674-926X(2015)02-016-04

1.國家自然科學(xué)基金委青年基金-基于"組分-藥效-靶點"作用網(wǎng)絡(luò)研究四物湯制備工藝環(huán)節(jié)評價模式（項目編號：81303238）；2.四川省科技支撐計劃項目-中藥質(zhì)量控制及產(chǎn)品開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究（編號：2014SZ0071)子課題：以四物合劑為模型的中藥口服液生產(chǎn)過程“譜效”質(zhì)量控制模式示范性研究

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

楊歡，男，藥劑學(xué)碩士，主要研究方向：中藥新技術(shù)、新工藝、新制劑研究

Tel:13880608823 Email:yhwrhyl@vip.qq.com。

何瑤，講師，主要研究方向：從事中藥新制劑、新劑型和新技術(shù)研究

Tel:13882280308 Email:20660306@qq.com

2014-09-12