唐宏武 曹迪 李誠(chéng)予 龐代文
(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北武漢430072)
1970年,美國(guó)科學(xué)家Ashkin[1]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),當(dāng)一束平行激光入射到微米級(jí)別的微球上時(shí),激光對(duì)微球存在一個(gè)沿光傳播方向的推力,之后發(fā)現(xiàn)當(dāng)一束高度會(huì)聚的激光束入射到微球上時(shí),對(duì)小球有一個(gè)指向光強(qiáng)最強(qiáng)處的拉力。結(jié)合這兩種現(xiàn)象,Ashkin[2]在1986年發(fā)明了光鑷這種微球操縱工具。
最近幾十年來(lái),我國(guó)在光鑷技術(shù)理論研究和應(yīng)用方面都有了很大的發(fā)展。在學(xué)科交叉領(lǐng)域,光鑷光源是單色性優(yōu)良的激光,可以用于對(duì)特定光譜的激發(fā),現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出光鑷與拉曼光譜結(jié)合的光鑷-拉曼光譜探測(cè)等新技術(shù)[3]。我國(guó)現(xiàn)有高校進(jìn)行光鑷研究的實(shí)驗(yàn)室一般使用專業(yè)科研級(jí)別的光鑷裝置,其價(jià)格較高,使光鑷的教學(xué)普及受到很大的限制。我們希望利用國(guó)產(chǎn)的正置顯微鏡代替昂貴的進(jìn)口倒置顯微鏡搭建一個(gè)光鑷系統(tǒng),同時(shí)采用光鑷的捕獲光源作為熒光基團(tuán)的激發(fā)光源,通過(guò)微球富集靶分子,實(shí)現(xiàn)靶分子的定量檢測(cè)。因此,激光既是光鑷光源,也是熒光信號(hào)的激發(fā)光源。DNA檢測(cè)在核酸特定序列分析、基因研究和癌癥早期診斷等方面具有十分重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以含有64個(gè)堿基的人乳頭瘤病毒16的DNA(T-16)為靶DNA分子,通過(guò)夾心法將其定量捕獲于微球表面,并通過(guò)本實(shí)驗(yàn)裝置對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。
光鑷又稱單光束梯度力光阱,是利用一束高度會(huì)聚的激光生成一個(gè)三維的光梯度力阱,對(duì)微球進(jìn)行捕獲和操控的技術(shù),利用的是光與物質(zhì)之間相互作用的力學(xué)效應(yīng)[4]。對(duì)于微米級(jí)別的粒子,可以用幾何光學(xué)方法來(lái)考察其與光的相互作用。我們選取透明的介電小球?yàn)槟P蛠?lái)闡釋光鑷的基本原理。在這里設(shè)介電小球的折射率大于周?chē)橘|(zhì)折射率。
光子具有動(dòng)量。當(dāng)光入射到物體上發(fā)生反射或折射時(shí),光將動(dòng)量傳遞給物體,同時(shí)產(chǎn)生壓強(qiáng),這種壓強(qiáng)稱為光壓,光壓與入射的光強(qiáng)呈正相關(guān)關(guān)系。對(duì)于宏觀物體,這種光壓可以忽略,但是對(duì)于微納尺度的粒子,這種光壓的作用非常明顯。
當(dāng)激光照射到透明微米級(jí)粒子上時(shí),光在微球的表面和內(nèi)部發(fā)生反射和折射,分別產(chǎn)生散射力和梯度力。散射力方向與光傳播方向一致,強(qiáng)度正比于光強(qiáng),梯度力方向指向光強(qiáng)最強(qiáng)位置,與光強(qiáng)的梯度變化成正相關(guān)。在平行光束中選取兩條光線a、b說(shuō)明二維勢(shì)阱的原理。實(shí)線表示入射光線和折射光線,虛線表示反射光,F(xiàn)a和Fb分別表示a、b兩條光線對(duì)小球的力,F(xiàn)表示合力。如圖1(a)所示,在非勻強(qiáng)光場(chǎng)中,小球的橫向受力指向光強(qiáng)更強(qiáng)處;而在圖1(b)的勻強(qiáng)光場(chǎng)中,小球的橫向受力為0。
二維勢(shì)阱由平行光形成,光強(qiáng)在傳播方向上(y方向)沒(méi)有梯度,故微球在y方向沒(méi)有梯度力來(lái)平衡散射力。微球到達(dá)光軸依然會(huì)沿光軸運(yùn)動(dòng),故單個(gè)二維光學(xué)勢(shì)阱無(wú)法完全束縛微球。通常用兩束相對(duì)傳播的光束照射微球,使其受到兩個(gè)等大反向的散射力,實(shí)現(xiàn)捕獲;或是在垂直光軸的平面上放置一個(gè)擋板,微球接觸擋板后彈力與散射力平衡,也能實(shí)現(xiàn)捕獲。
激光在光軸方向具備光強(qiáng)梯度才能產(chǎn)生軸向梯度力來(lái)與散射力平衡,以實(shí)現(xiàn)單光束梯度力捕獲。通常讓激光束通過(guò)透鏡或物鏡,使平行激光高度會(huì)聚,獲得軸向光強(qiáng)梯度。這種高度會(huì)聚的光束產(chǎn)生的勢(shì)阱稱為三維勢(shì)阱。圖2為三維勢(shì)阱中微球的受力分析。結(jié)合圖2,可知微球的中心在會(huì)聚光束焦點(diǎn)f的下方或上方,梯度力的合力F的方向均指向焦點(diǎn)位置,當(dāng)梯度力合力大小與散射力平衡時(shí),微球便可被單光束激光捕獲。
圖1 二維勢(shì)阱中微球受力分析
圖2 三維勢(shì)阱中微球受力分析
光鑷的發(fā)展經(jīng)歷了二維光學(xué)勢(shì)阱到三維光學(xué)勢(shì)阱兩個(gè)階段;形成能完全束縛微球的三維光學(xué)勢(shì)阱需使用高倍物鏡。而在實(shí)際應(yīng)用中,有時(shí)并不需要完全捕獲微球,也不需過(guò)高的放大倍數(shù),這時(shí)便可使用低倍物鏡,形成一個(gè)會(huì)聚程度較低的光束來(lái)捕獲微球。低會(huì)聚光束的軸向梯度力弱,無(wú)法平衡軸向散射力,故捕獲微球的過(guò)程是先將微球吸入光斑中心,然后將其沿光傳播方向推出,微球在光束的散射力和容器底/頂?shù)膹椓Φ淖饔孟蚂o止。這種形式類(lèi)似二維光學(xué)勢(shì)阱的捕獲,但又是在三維光學(xué)勢(shì)阱中實(shí)現(xiàn)的,故稱其為三維光學(xué)勢(shì)阱的二維捕獲。
熒光檢測(cè)是分析化學(xué)中的一種重要檢測(cè)手段。近年來(lái),該檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是研究新型的熒光標(biāo)記物,如熒光蛋白[5]和量子點(diǎn)[6-8]等,二是開(kāi)發(fā)新的熒光檢測(cè)方法如流式細(xì)胞術(shù)[9]和共聚焦熒光顯微鏡等。
本實(shí)驗(yàn)采用的光鑷-熒光分析檢測(cè)方法是一種基于單個(gè)微球富集待測(cè)分子高靈敏度高選擇性的定量分析方法,其檢測(cè)對(duì)象是微米級(jí)的偶聯(lián)復(fù)合微球。偶聯(lián)復(fù)合微球是由微球探針偶聯(lián)靶DNA后再連接標(biāo)記有量子點(diǎn)的互補(bǔ)DNA制備得到。熒光的激發(fā)需要高能的激發(fā)光源,而光鑷的激光光源具有單色性好、能量集中等優(yōu)點(diǎn),能滿足熒光激發(fā)光源的要求,故可以將光鑷與熒光檢測(cè)相結(jié)合,檢測(cè)被捕獲的微球的熒光。
選用量子點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)熒光染料作為熒光標(biāo)記物。量子點(diǎn)是一種性能卓越的熒光標(biāo)記物,具有亮度高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、抗光漂白能力強(qiáng)等一系列優(yōu)點(diǎn)。由于激光的能量高且集中,需要熒光標(biāo)記物具有良好的耐光漂特性,量子點(diǎn)滿足實(shí)驗(yàn)要求。并且量子點(diǎn)的一元激發(fā)、多元發(fā)射的特性也使得多元檢測(cè)成為可能。
下面以濃度為30nmol/L的靶DNA為例,簡(jiǎn)要介紹偶聯(lián)復(fù)合微球的制備過(guò)程。
微球探針的制備分為兩步,先將羧基微球表面修飾上親和素,然后利用生物素-親和素這種高效特異性反應(yīng)[10],使微球表面能夠牢固地結(jié)合捕獲DNA。移取15μL 50mg/mL直徑大小為3μm的羧基聚苯乙烯微球(阿拉丁,中國(guó))至離心管中,加入100μL 10mmol/L MES緩沖溶液(pH5.0)洗滌兩次。洗滌完畢后,依次加入40μL 1mg/mL親和素(Sigma-Aldrich,美國(guó)),3.6μL 10mg/mL EDC(Sigma-Aldrich,美國(guó))水溶液,室溫條件下,在搖床中培育1.5h后,補(bǔ)加1.8μL 100mg/mL EDC水溶液,繼續(xù)培育1.5h,總反應(yīng)時(shí)間為3h。隨后,將表面修飾有親和素的聚苯乙烯微球與30μL 10μmol/L 3'端修飾生物素的捕獲DNA(生工,上海,序列為5'-GTGTGGATAATAGAGAATGTATATCTATGG-Biotin-3')混合均勻,加入100μL 0.01mol/L PBS緩沖溶液(pH7.2),在微量振蕩器中反應(yīng)2h,得到微球探針,殘余的捕獲DNA可通過(guò)離心的方式除去。最后,將制得的微球探針懸浮于100μL雜交緩沖溶液中(20mmol/L Tris,pH8.0,200nmol/L NaCl),4℃下保存。
量子點(diǎn)探針的制備同樣是依據(jù)鏈霉親和素-生物素高效特異性結(jié)合的原理來(lái)反應(yīng)。依次移取30μL 10μmol/L 5'端修飾生物素的探針DNA(序列為5'-Biotin-ACAGAAAATGCTAGTGCTTATGCAAAT-3')和3.0μL 1μmol/L表面修飾鏈霉親和素的CdSe/ZnS量子點(diǎn)(發(fā)射波長(zhǎng)605nm,武漢珈源量子點(diǎn)公司)至離心管中混合均勻,然后補(bǔ)加50μL 0.01mol/L PBS緩沖溶液(pH7.2),在微量振蕩器中反應(yīng)1h,得到量子點(diǎn)探針,殘余的探針DNA可通過(guò)超濾的方式除去。最后,將制得的量子點(diǎn)探針懸浮于50μL雜交緩沖溶液中(20mmol/L Tris,pH8.0,200nmol/L NaCl),4℃下保存。
雜交過(guò)程采用簡(jiǎn)單、快速的一步法雜交反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。將上述制備的微球探針、量子點(diǎn)探針與30μL 1μmol/L目標(biāo)DNA(T-16,序列為5'-CCATAGATATACATTCTCTATTATCCACACCTGCATTTGCTGCATAA GCACTAG CATTTTCTGT-3')混合均勻,在45℃條件下,在搖床中培育2h后,洗滌兩次,除去殘余的目標(biāo)DNA。最后,將偶聯(lián)復(fù)合微球懸浮于100μL雜交緩沖溶液中(20mmol/L Tris,pH8.0,200nmol/L NaCl),4℃下保存。利用倒置熒光顯微鏡(尼康,ECLIPSE TE2000-U,日本),以藍(lán)光為激發(fā)光源拍攝的偶聯(lián)復(fù)合微球如圖3所示。
圖3 偶聯(lián)量子點(diǎn)的復(fù)合微球的顯微熒光照片
光鑷裝置通常由激光光源、耦合光路、顯微鏡和移動(dòng)控制平臺(tái)組成。通常加裝CCD或CMOS攝像頭,搭配計(jì)算機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)圖像記錄。目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室所用顯微鏡多為較昂貴的倒置熒光顯微鏡,Stephen P等人提出一種用有限遠(yuǎn)正置顯微鏡系統(tǒng)構(gòu)建光鑷的方法[11],但該方法非常復(fù)雜,不利于教學(xué)推廣。我們參考無(wú)限遠(yuǎn)顯微鏡光鑷的結(jié)構(gòu),對(duì)現(xiàn)有的國(guó)產(chǎn)有限遠(yuǎn)正置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)進(jìn)行改造,拆除光路中的透鏡,僅留下激光通路及光路中的二向色鏡DM,同時(shí)將物鏡替換成無(wú)限遠(yuǎn)物鏡,這樣就將有限遠(yuǎn)系統(tǒng)顯微鏡改造為無(wú)限遠(yuǎn)顯微鏡。本套裝置采用三維勢(shì)阱的二維捕獲(以下簡(jiǎn)稱二維捕獲)方式捕獲微球,物鏡為無(wú)限遠(yuǎn)40×物鏡(Olympus NA 0.60)。低倍物鏡透光率較高,可降低激光透過(guò)后的功率損失。二維捕獲將微球捕獲到容器底/頂部光斑光強(qiáng)最強(qiáng)處,既可使微球位置穩(wěn)定,實(shí)現(xiàn)最大程度的熒光激發(fā),也可使每個(gè)微球的熒光激發(fā)條件保持一致。
如圖4所示,光源采用波長(zhǎng)473nm,功率0~130mW可調(diào)的DPSS激光器(長(zhǎng)春鐳仕光電科技有限公司MW-BLN-473)。激光經(jīng)過(guò)L1和L2透鏡組擴(kuò)束準(zhǔn)直后,經(jīng)DM反射進(jìn)入物鏡后瞳,經(jīng)物鏡聚焦成為一束會(huì)聚激光,形成光學(xué)勢(shì)阱,對(duì)微球進(jìn)行捕獲。
捕獲激光同時(shí)用于熒光標(biāo)記物的激發(fā)。量子點(diǎn)熒光信號(hào)由與顯微鏡結(jié)合的光譜儀采集。光譜儀由光柵單色儀(北京光學(xué)儀器廠,WDG30)和線陣CCD(日本濱松,S7031-1007)構(gòu)成。由于雙色分光鏡DM不能完全過(guò)濾熒光信號(hào)中混有的激光,通過(guò)單色儀分光可分離殘余的激光。調(diào)整光柵的角度可以將熒光或激光信號(hào)聚焦投影到適當(dāng)?shù)腃CD檢測(cè)范圍。對(duì)于多色量子點(diǎn)熒光信號(hào),可通過(guò)光柵分光后分別檢測(cè),此時(shí)CCD為多通道檢測(cè)器。
實(shí)驗(yàn)中所用復(fù)合微球的基底為直徑3μm的聚苯乙烯微球。復(fù)合微球分散于石英載玻片和石英蓋玻片之間的液膜中,如圖5所示。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,移動(dòng)二維載物臺(tái)使微球靠近光斑,當(dāng)接近光斑中心時(shí),微球被吸入光斑中心,其后被壓在載玻片的上表面。此時(shí)移動(dòng)載物臺(tái),發(fā)現(xiàn)微球相對(duì)光斑中心保持靜止,可知微球已被光阱捕獲。
圖4 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖
圖5 三維勢(shì)阱的二維捕獲示意圖
將顯微鏡明場(chǎng)光源關(guān)閉,可觀察到光阱中偶聯(lián)復(fù)合微球的紅色熒光,再將顯微鏡從目鏡觀察模式切換到信號(hào)檢測(cè)模式,可從配套軟件界面讀出此時(shí)微球的熒光強(qiáng)度值。由圖6可以看出,經(jīng)過(guò)單色儀分光和譜帶位置調(diào)整,殘留藍(lán)光已被移出CCD的檢測(cè)范圍,譜圖中僅剩紅色的量子點(diǎn)熒光信號(hào)峰。
用相同的制備方法分別制備2.5、5.0、10.0、20.0和30.0nmol/L 5種不同靶DNA濃度下的偶聯(lián)復(fù)合微球,利用光鑷-熒光定量檢測(cè)裝置檢測(cè),在相同的激光功率激發(fā)下,當(dāng)CCD積分時(shí)間為7ms時(shí),測(cè)得對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度,每種濃度下的熒光強(qiáng)度均為檢測(cè)50個(gè)不同微球熒光峰的統(tǒng)計(jì)平均結(jié)果。圖7為6種富集不同濃度靶DNA(即上述5個(gè)濃度和空白)的單個(gè)復(fù)合微球的熒光光譜。結(jié)果表明:熒光強(qiáng)度ⅠF與c(T-16)在0~30nmol/L之間呈線性關(guān)系(圖8),隨著靶DNA濃度的增大,偶聯(lián)復(fù)合微球的熒光強(qiáng)度也隨之升高,ⅠF=2.96c(T-16)+24.72,相關(guān)系數(shù)為0.9745。通過(guò)測(cè)量空白樣品,得到本檢測(cè)方法的檢出限(3σ,其中σ表示空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差,n=11)為1.4nmol/L。實(shí)驗(yàn)表明,方法的靈敏度與CCD積分時(shí)間顯著相關(guān),當(dāng)積分時(shí)間為50ms時(shí),方法的檢出限可以降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。
本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的國(guó)產(chǎn)正置顯微鏡,經(jīng)過(guò)改造,構(gòu)建了一臺(tái)簡(jiǎn)易的光鑷裝置,并成功實(shí)現(xiàn)了單個(gè)微球的二維捕獲。同時(shí)利用激光的特性,將熒光檢測(cè)技術(shù)與光鑷裝置相結(jié)合,在實(shí)現(xiàn)微球捕獲操縱的同時(shí),對(duì)復(fù)合微球的熒光進(jìn)行了定量檢測(cè),測(cè)定了熒光強(qiáng)度-靶DNA濃度的工作曲線。由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)微球的操縱要求不高,故采用了三維光阱的二維捕獲這種捕獲方式,同時(shí)也利用了這種捕獲方式不需要高倍物鏡的特點(diǎn),有效地降低了激光能量的損失,提高了熒光激發(fā)強(qiáng)度。量子點(diǎn)具有發(fā)射峰窄、耐光漂白等優(yōu)良特性,因此非常適合作為以激光為激發(fā)光源的熒光標(biāo)記物。
圖6 單色儀分光后測(cè)得的光鑷捕獲單個(gè)微球的熒光光譜(量子點(diǎn)標(biāo)記)
圖7 6種富集不同濃度靶DNA的單個(gè)復(fù)合微球的熒光光譜
圖8 熒光強(qiáng)度-靶DNA工作曲線
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)DNA的檢測(cè),成功地對(duì)方法的原理和通用性進(jìn)行了驗(yàn)證。也可以通過(guò)偶聯(lián)抗體或DNA適配體等方法來(lái)特異性富集血清中腫瘤標(biāo)志物等分子,用于患者血清生化指標(biāo)檢查和癌癥診斷等方面,因此本實(shí)驗(yàn)裝置在生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
[1]Ashkin A.Phys Rev Lett,1970,24(4):156
[2]Ashkin A,Dziezic J M,Bjorkholm J E,et al.Opt Lett,1986,288(11):288
[3]黃超,王強(qiáng),姚輝璐,王桂文,等.分析化學(xué),2007,35(10):1410
[4]李銀妹.生命科學(xué)新技術(shù)——光鑷原理、技術(shù)和應(yīng)用.合肥:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社,1996
[5]Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G,et al.Science,1994,263:802
[6]Chan W C W,Nie S.Science,1998,281:2016
[7]Han M,Gao X,Su J Z,et al.Nat Biotechnol,2001,19:631
[8]Chan W C W,Maxwell D J,Gao X,et al.Curr Opin Chem Biol,2002,13:40
[9]Gucker F T,O'Konskl G T,Plckard H B,et al.J Am Chem Soc,1947,68:2422
[10]Hermanson G T.Bioconjugate Techniques.New York:Academic Press,1996
[11]Smith S P,Bhalotra S R,Brody A L,et al.Am J Phys,1998,67(1):26