朱海林，王振洲，高爽，李平亞，劉金平※

(1．吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，長春 130021； 2．中國藥科大學(xué)，南京 210009)

中醫(yī)藥在中國已經(jīng)發(fā)展幾千年，并且形成了自己的獨特理論。在臨床治療上具有毒副作用小、作用持久以及耐受性差等特征[1]。近年來，由于多靶點藥物研發(fā)的興起以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、各種組學(xué)等新的分析研究手段的出現(xiàn)，世界各國對中藥關(guān)注度和認(rèn)可度明顯上升[2]。但是，由于中藥在分子水平上對人體作用機制的研究還不夠清晰，從而阻礙了中醫(yī)藥的現(xiàn)代化以及走出國門[3]。如何在探索機制的同時又突顯出中醫(yī)藥理論的精髓成為亟待解決的問題。不同于“單成分-單靶點”的作用過程，中藥的多組分作用于多個靶點，研究時需要注重靶點或成分之間的關(guān)聯(lián)。確證中藥作用的靶點，對闡明我國傳統(tǒng)藥物的作用機制具有重要的理論價值，也為中藥的臨床應(yīng)用提供重要參考。近年來，隨著生物信息學(xué)和計算機科學(xué)的發(fā)展，涌現(xiàn)了多種靶點預(yù)測、識別和確證的方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可對大量的靶點進行初步篩選，將中藥可能作用的靶點做一個排序；計算機輔助藥物設(shè)計在合理藥物設(shè)計的同時對闡述中藥多靶點的機制也有重要意義；由于90%的已知藥物靶點為蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)組學(xué)在實驗水平上驗證潛在的作用靶點提供了客觀上的可能性。此外，多種技術(shù)手段聯(lián)用也可進一步提高多靶點預(yù)測的準(zhǔn)確性。

1 基于計算方法的中藥靶點的預(yù)測和識別途徑

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[4](Network pharmacology)通過將活性成分、作用靶點和疾病的關(guān)系在計算機上以數(shù)學(xué)計算模型的方式表現(xiàn)出來。運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥的模式主要是從已有的相關(guān)文獻和數(shù)據(jù)庫獲取大量相關(guān)的靶點和化合物信息，經(jīng)過口服生物利用度、五倍律等一系列預(yù)篩選，建立藥物-靶點-疾病的相關(guān)模型，預(yù)測結(jié)果由文獻佐證或?qū)嶒炦M一步驗證。吳磊宏等[5]將附子中22個化學(xué)成分與DrugBank中的已知靶點構(gòu)建預(yù)測集，對網(wǎng)絡(luò)模型分析后發(fā)現(xiàn)，共涉及75個靶點，單個靶點與平均4.77個化合物相關(guān)，每個成藥性良好的成分平均與16.3個靶點作用。附子預(yù)測的潛在作用靶點均得到了文獻的證實，證明此方法可用于發(fā)現(xiàn)中藥的某些潛在作用靶點。

作為新興的交叉學(xué)科，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不僅能夠揭示單味中藥的作用機制，還能將古老的中藥方劑和現(xiàn)代科學(xué)連接，揭示中藥成方的作用機制[6，7]。李翔等[8]在復(fù)方丹參方中選取9個具有活性的化合物，與相關(guān)的疾病和基因在Cytoscape中構(gòu)建3者相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)模型。結(jié)果顯示，復(fù)方丹參方中的9個活性成分可調(diào)控與30多種心血管疾病相關(guān)的42種基因的表達。Tao等[9]以郁金散為例研究心腦血管疾病的發(fā)病機制，經(jīng)過口服生物利用度、類藥性模型篩選候選活性成分，結(jié)果，從郁金散中找出了58個具有生物活性的化學(xué)成分，通過建立靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測了32個與心腦血管疾病相關(guān)的靶點。

臨證加減理論(AST)是傳統(tǒng)中醫(yī)藥中的基本用藥理論，Li等[10]將大柴胡湯和小柴胡湯中所有中藥的已知化學(xué)成分從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載下來，經(jīng)過口服利用度及藥物半衰期初步預(yù)測，篩選的化學(xué)成分基于random forst(RF)和support vector machine(SVM)方式分別建立藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)和靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明，在64個候選化合物中有23個化合物與超過14個靶蛋白同時作用。并且，有部分靶蛋白和多種候選藥物同時作用，如PGHS-1這種與肺癌相關(guān)的靶蛋白和多個藥物成分高度相關(guān)。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用主要有：從中藥中發(fā)現(xiàn)活性良好的小分子候選化合物，為藥物的合理設(shè)計提供先導(dǎo)化合物；將其與中醫(yī)藥理論契合在一起，有助于揭示君臣佐使、四氣五味等中藥理論；借助于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強大的儲存生物學(xué)數(shù)據(jù)功能，使其以一個系統(tǒng)的視角分析如AD等復(fù)雜疾病的發(fā)病機制。

1.2 計算機輔助藥物設(shè)計

計算機輔助藥物設(shè)計[11](computer aided drug design，CADD)方法是以計算機為工具，應(yīng)用配體-受體相互作用原理，采用各種理論計算方法和分子構(gòu)象模擬技術(shù)，根據(jù)積累的大量活性化合物構(gòu)效關(guān)系研究成果，設(shè)計出具有某一藥效的先導(dǎo)化合物。虛擬篩選與藥效團設(shè)計是CADD中應(yīng)用廣泛的2種方法。虛擬篩選主要是以分子對接、反向分子對接等為代表，廣義地說，任何一種基于某種提問形式，從現(xiàn)有的小分子數(shù)據(jù)庫中搜尋符合條件的化合物都可稱為虛擬篩選。目前有眾多運用于CADD的服務(wù)器，例如PLANTS、GOLD、DOCK Blaster、LEA3D、3DLigandsite、PharmMapper等。

分子對接用于探究中藥的潛在靶點和作用機制以及研究中藥成方的藥理作用機制[12，13]。Chang等[14]通過對天然藥物進行分子對接的虛擬篩選，以期從中得到新的抗炎因子。20 000多種中藥活性成分與mPGES-1進行對接，得到奎尼酸等有良好抗炎作用的天然活性成分。羅麗萍[15]在MVD(Molecular Virtual Docker 5.5)中將12種花青素類活性分子和以HER-2酪氨酸激酶區(qū)為受體模板創(chuàng)建的位點進行分子水平的對接試驗。結(jié)果顯示，12種活性成分均作用于HER-2激酶區(qū)中ATP與HER-2作用的活性腔，預(yù)測花青素是以競爭性結(jié)合方式發(fā)揮抗癌作用的。潘婷婷等[16]選擇30個中藥有效成分與PAR-1受體通過Schr?dinger軟件中的Glide模塊進行分子對接，尋找可能的拮抗劑。結(jié)果顯示，虛擬篩選出的活性成分隱丹參酮等具有確切的拮抗作用，并且已經(jīng)得到相關(guān)的分子生物學(xué)實驗的驗證。劉美鳳[17]使用Discovery Studio 2.1中的CDOCKER模塊，將番石榴葉中32個小分子與糖尿病有關(guān)的4個生物活性酶分子對接后發(fā)現(xiàn)，番石榴葉的黃酮類和鞣質(zhì)化合物與PTP1B和PPARγ結(jié)合緊密。并且預(yù)測可以通過引入疏水基團加強其降糖的功效。反向分子對接[18]是以小分子化合物為探針，在已知的靶點數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索可能與其結(jié)合的受體蛋白，直接發(fā)現(xiàn)活性成分的靶點。這種實驗方法思路清晰、簡單。陳少軍[19]使用PharmMapper服務(wù)器對茯苓酸和丹參醇A進行反向分子對接，計算得出相關(guān)的配體分子。驗證表明，Trasthyretin、Vitamin D3 receptor、Corticosteriod 11 beta dehydrogenase isozyme 1為茯苓酸的靶點，醛糖還原酶可能是丹參醇A的靶蛋白之一。

藥效基團模型法是一種通過分析一組中藥活性分子的藥效構(gòu)象，找出共同的特征結(jié)構(gòu)，建立藥效基團模型，以此檢索三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)符合藥效基團要求的化合物，與中藥成分結(jié)構(gòu)比對，評價中藥各成分的生物活性和成藥性。常見的軟件系統(tǒng)有Unity-2、Catalyst和Apex-3D。王星等[20]采用該方法研究辛味藥性與TRPV1之間的關(guān)系。結(jié)果證明，由16個已知的TRPV1激動劑構(gòu)建的藥效團模型不但命中包括辣椒素、吳茱萸堿、桂皮醛等來源于辛味中藥的活性成分，而且揭示了TRPV家族與辛味藥性之間的相關(guān)關(guān)系。

計算機輔助藥物設(shè)計將古老的中藥和當(dāng)今科學(xué)銜接起來，在發(fā)現(xiàn)和驗證中藥活性成分的潛在靶標(biāo)起著重要作用，同時，可以減少藥物靶點設(shè)計的時間和金錢成本，對中藥復(fù)方的作用機制研究提供了新的思路和依據(jù)。

2 基于實驗方法的中藥靶點識別和確證途徑

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是一門以生物體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的存在、表達、相互作用等活動方式為研究對象的學(xué)科。對于中藥多靶點的研究，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)對不同靶蛋白識別或從眾多蛋白中分辨出靶蛋白是一個高效的途徑[21]。

張麗軍[22]依據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的高通量、高靈敏度等特點將其運用于探究唐草片抗病毒的作用機制。研究采用SDS-PAGE分離微粒體蛋白質(zhì)、切取CYP450酶對應(yīng)分子量的條帶、通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行鑒定，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方法對鑒定的CYP2C11進行定量分析。結(jié)果證實了唐草片對CYP450代謝酶和CYP2C11的表達變化。姚辛敏[23]利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究地黃飲子對AD細(xì)胞模型的影響，進一步闡明地黃飲子治療AD的機制；研究比較了模型組和地黃飲子組對AD細(xì)胞模型的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和給藥組均能上調(diào)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達，推測地黃飲子在治療AD發(fā)病初期機理可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞中有關(guān)的蛋白質(zhì)點起動，從而保護受損細(xì)胞。戎志斌[24]使用蛋白芯片質(zhì)譜儀對柴胡疏肝散組、對照安理申組、空白組的含藥血清進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，觀察飛行時間質(zhì)譜狀圖發(fā)現(xiàn)，二者對機體的藥理作用存在顯著差異。Sun等[25]使用二維凝膠電泳和基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀尋找銀柴胡湯治療肝損傷的靶蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15個蛋白位點在治療前后發(fā)生了改變，其中鋅指蛋白407、凝血酶原、結(jié)合珠蛋白等7個蛋白顯著下調(diào)。Zohreh Firouzi等[26]在對姜黃中的姜黃素進行生物活性和副作用評價時，先采用親和色譜法純化出與其作用的相關(guān)蛋白質(zhì)，在此基礎(chǔ)上使用二維凝膠電泳和質(zhì)譜進一步遴選和鑒別作用蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，姜黃素能夠和細(xì)胞內(nèi)一系列的結(jié)構(gòu)蛋白、代謝酶和參與體內(nèi)細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮藥理作用。

一般蛋白質(zhì)組學(xué)在中藥靶點方面的研究主要流程為：樣品(來源于培養(yǎng)的細(xì)胞、人或動物)在與中藥(單個化合物或復(fù)方)結(jié)合后運用二維凝膠電泳和染色技術(shù)，比較表達有差異的蛋白質(zhì)，將差異蛋白進行消化和質(zhì)譜分析，最后經(jīng)一系列生物信息學(xué)和體內(nèi)或體外的藥效學(xué)研究推斷出作用靶點和生物通路[27，28]。研究的基本策略也是蛋白質(zhì)組之間的比較，即給藥前、后的樣本組織、細(xì)胞或體液的蛋白質(zhì)表達量的上調(diào)或下降。

2.2 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)[29](Biochip)是在微加工以及微電子兩項技術(shù)基礎(chǔ)上，通過建立的固體基質(zhì)表面微型生化分析系統(tǒng)，從而對生命體內(nèi)的生物組分(蛋白質(zhì)、核酸等)進行快速檢測。生物芯片包括蛋白質(zhì)芯片與基因芯片，二者原理相類似，都是在分子間特異地相互作用基礎(chǔ)上發(fā)展而來。

李英博等[30]利用MTT比色法確定了人參皂苷Rg1促進人神經(jīng)干細(xì)胞增殖的最佳濃度后，采用基因芯片雜交技術(shù)，獲取了基因表達的信號強弱，運用相關(guān)的圖像和數(shù)據(jù)分析軟件進行分析。結(jié)果顯示，促進人神經(jīng)干細(xì)胞增殖差異基因中顯著上調(diào)的266個，下調(diào)的174個，這些基因和CAMP-PKA以及PL3K-AKT信號傳導(dǎo)通路有密切關(guān)系。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是在基因芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，了解一個基因的功能，必須最終在蛋白質(zhì)水平上確認(rèn)。玄毅等[31]運用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，對注射了魚腥草的實驗動物中血清蛋白進行蛋白組檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚腥草注射液對3511Da、3522Da、7981Da、3960Da、3975Da等蛋白有調(diào)節(jié)作用。

生物芯片技術(shù)具有分析靈敏、重現(xiàn)性好、自動化等特點[32]，在新藥靶點的篩選方面具有廣闊應(yīng)用前景。

3 基于聯(lián)用技術(shù)的中藥靶點確證途徑

中藥作用的機制強調(diào)的是整體性、協(xié)同性，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)、系統(tǒng)藥理學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種技術(shù)手段能夠有力地推動中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，它的出現(xiàn)同時增加了當(dāng)前新藥研發(fā)的方法[32]。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要是從理論上驗證或預(yù)測組合藥物靶點[33～35]。越來越多的科研工作者采用聯(lián)用的方法，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果現(xiàn)實證據(jù)。例如，利用組學(xué)技術(shù)或高通量技術(shù)，觀察藥物對模型(細(xì)胞或動物)的作用或模型對藥物的作用，針對所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上建立藥物、靶點和疾病三者的網(wǎng)絡(luò)，進一步闡明藥物可能的作用機理。劉慶山[36]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)合理選擇相關(guān)靶點，然后建立高通量篩選的方法對復(fù)方白脈散全組分進行篩選和活性評價，取得理想的效果，并且預(yù)測高內(nèi)涵篩選方法對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用將起到推動作用。

Ⅱ型糖尿病是一種慢性病，發(fā)病原因復(fù)雜，中藥中的多種成分可以同時作用多個靶標(biāo)，從而達到治療的效果。Gu等[37]利用軟件Cerius2的定量構(gòu)效關(guān)系模型對糖敏靈中676個化合物進行整體性描述，通過LigandFit將其與37個相關(guān)的糖尿病靶蛋白進行分子對接，將分?jǐn)?shù)排在前3%的分子和靶蛋白構(gòu)建了藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)，與共有靶標(biāo)超過一個的小分子構(gòu)建藥物-藥物網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果揭示了糖敏靈中的活性成分，有些并且已經(jīng)得到文獻證實。Chen等[38]在研究扶正抑瘤湯的抗癌機制時首先采用指紋圖譜技術(shù)進行分析得出21個主要的扶正抑瘤湯成分，將其分別與Bcl-xl、IL-2、TNF-α等進行分子對接，評價它們的抗癌活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性成分對3個因子的釋放均有不同程度的抑制作用。丁俊杰[39]對ω-芋螺毒素進行定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)研究，建立相關(guān)的虛擬組合多肽庫，分別采用QSAR模型預(yù)測和相似性搜索2種方法對多肽庫進行篩選。結(jié)果得出6個N-型和19個P/Q-型鈣離子通道拮抗劑。多種虛擬篩選的方法同時使用，提高了擊中靶點的概率。

4 小結(jié)與展望

如上，常見的用于尋找中藥靶點的技術(shù)都是建立在強大的信息支持上，在應(yīng)用過程中都使用了較多的數(shù)據(jù)庫。如何在追求數(shù)據(jù)總量的基礎(chǔ)上使科研工作者獲取數(shù)據(jù)的有序性影響著數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為科研成果的概率，并且處理數(shù)據(jù)的服務(wù)器朝著更易操作的方向發(fā)展。中藥靶點的預(yù)測和確證方法大多是多學(xué)科融合的，比如網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是由系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、計算機信息學(xué)等多學(xué)科共同組成的交叉學(xué)科[40]，只有借助于多種工具共同發(fā)展，逐漸從一個成分、一個靶點的思路向多成分、多靶點轉(zhuǎn)變，注重成分之間的協(xié)同作用、靶點之間的聯(lián)系，才能使中藥走得更遠(yuǎn)。

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