王士勇，楊月春，2，李曉霞，刁云飛，梁永軍，許保增※

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130112；2．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林 132012；3．吉林省四平市鐵西區(qū)畜牧管理服務(wù)中心，吉林 四平 136000)

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞冷凍保存研究一直備受人們關(guān)注，一方面，冷凍保存卵母細(xì)胞是動(dòng)物遺傳資源保存的一種重要手段；另一方面，隨著哺乳動(dòng)物胚胎工程技術(shù)的日益發(fā)展，對卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量要求越來越高；同時(shí)，人類輔助生殖研究需要卵母細(xì)胞冷凍保存作為技術(shù)支撐。到目前為止，人們對多種動(dòng)物的體細(xì)胞冷凍保存技術(shù)已經(jīng)成熟，但是卵母細(xì)胞的冷凍保存效率還遠(yuǎn)低于其他細(xì)胞，其原因可能是卵母細(xì)胞體積大、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和滲透性與其他細(xì)胞相異、冷凍過程中對冷凍保護(hù)劑造成的滲透壓變化較敏感等[1]。近年來，人們對卵母細(xì)胞冷凍保存研究做了細(xì)致的探索和研究，提出了很多新技術(shù)、新方法和新觀點(diǎn)。眾所周知，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞冷凍保存一般包括添加抗凍保護(hù)劑、冷凍保存、解凍復(fù)蘇和洗脫冷凍保護(hù)劑等幾個(gè)步驟，每一步操作都會(huì)由于滲透壓差造成卵母細(xì)胞的體積變化而導(dǎo)致其微結(jié)構(gòu)損傷甚至死亡[2]。本文就卵母細(xì)胞冷凍保存研究中所涉及的方法、載體、抗凍保護(hù)劑和新的研究觀點(diǎn)進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步研究和改進(jìn)卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)提供參考。

1 冷凍方法

冷凍方法是影響卵母細(xì)胞冷凍效果的一個(gè)重要因素，常用的卵母細(xì)胞冷凍方法有慢速冷凍法和玻璃化冷凍法(快速冷凍法)2種。

1.1 慢速冷凍方法

卵母細(xì)胞進(jìn)行慢速冷凍時(shí)需要采用程序降溫儀，其價(jià)格昂貴，操作步驟繁瑣，降溫時(shí)間較長，對卵母細(xì)胞解凍后的體外受精率、卵裂率及囊胚發(fā)育率影響較大，而且，在冷凍除人以外的動(dòng)物未成熟卵母細(xì)胞時(shí)效果并不如意，雖然有移植后獲得了成活個(gè)體的報(bào)道[3，4]，但逐步被玻璃化冷凍方法所取代。Lim等[5]利用慢速冷凍法冷凍牛卵母細(xì)胞的研究表明，成熟與未成熟卵母細(xì)胞的抗凍性具有差異，凍融方法影響冷凍卵母細(xì)胞解凍后的存活率和發(fā)育能力。研究表明[6，7]，采用慢速冷凍方法冷凍卵母細(xì)胞時(shí)，成熟的卵母細(xì)胞冷凍后其受精能力、發(fā)育率和胚胎質(zhì)量要明顯優(yōu)于未成熟的。但是在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)，往往取得的卵母細(xì)胞恰恰是未成熟的，所以其應(yīng)用范圍非常受限。

1.2 玻璃化冷凍方法

玻璃化冷凍保存不需昂貴的程序冷凍儀器，但是其效果較慢速冷凍明顯行之有效，是目前普遍采用的卵母細(xì)胞冷凍方法。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單快捷、降溫迅速，能夠減少在冷凍過程中形成的冰晶，降溫過程中卵母細(xì)胞內(nèi)、外溶液呈玻璃樣，從而避免形成冰晶所帶來的機(jī)械性損傷。但是該方法也存在不可忽視的缺點(diǎn)，因?yàn)椴ＡЩ鋬鰰r(shí)添加高濃度的冷凍保護(hù)劑容易引起化學(xué)中毒[8]，一旦操作過慢還可能會(huì)引起強(qiáng)烈地滲透損傷，從而破壞卵母細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致紡錘體和染色體結(jié)構(gòu)異常，凍融后卵母細(xì)胞的存活率、形態(tài)正常率、受精率和發(fā)育力等有所下降[9]。實(shí)現(xiàn)玻璃化冷凍通常有2條途徑，一條是極大地提高冷卻速率，另一條是增加保護(hù)劑的濃度[10]。因此，盡量選擇化學(xué)毒性小的冷凍保護(hù)劑及組合比例以及縮短冷凍液處理時(shí)間是玻璃化冷凍效果好壞的關(guān)鍵之一。

2 常用的冷凍載體

卵母細(xì)胞冷凍保存時(shí)，為了解凍后回收方便，一般需要將卵母細(xì)胞裝在載體中冷凍，常用的冷凍載體主要有冷凍細(xì)管、開放性拉長細(xì)管(Open Pulled Straw，OPS)和冷凍環(huán)(Cryoloop)等，也有人用玻璃微管(Glass micropipette vitrification，GMP)、封口式拉長細(xì)管(Closed Pulled Straw，CPS)、塑料微量吸頭(Plastic micropipette)和電鏡銅網(wǎng)(electron microscope grids，EMG)等載體[11]。選擇冷凍載體時(shí)盡量選擇容納冷凍液容積較小且熱導(dǎo)性較好的，這樣冷凍液降溫速度快。

2.1 冷凍細(xì)管

冷凍卵母細(xì)胞采用的細(xì)管載體通常為冷凍精液所用的麥管。在卵母細(xì)胞冷凍研究之初，由于細(xì)管冷凍較適宜程序冷凍儀、能夠進(jìn)行批量冷凍而受到廣泛關(guān)注，并在胚胎冷凍上達(dá)到商用水平，但這種載體采用慢速冷凍時(shí)同樣操作時(shí)間較長，需要昂貴的儀器，因?yàn)榧?xì)管溫度下降速率受其導(dǎo)熱性差所影響，降溫相對較慢，容易加大滲透性抗凍保護(hù)劑對卵母細(xì)胞的毒性損傷，隨著冷凍效果越來越被關(guān)注和拉長細(xì)管的開發(fā)使用而逐漸呈被淘汰趨勢。

2.2 拉長細(xì)管

拉長細(xì)管主要分為2種，一種是開放的拉長細(xì)管，一種是封閉的拉長細(xì)管。OPS法是將細(xì)管加熱后拉長變細(xì)，管壁變薄，這樣細(xì)管容積變小，裝載微量冷凍液即可完成冷凍保存過程，極大提高了冷凍速度，其降溫速率能達(dá)到20 000℃/min以上[11]。OPS技術(shù)是為超快速玻璃化冷凍技術(shù)設(shè)計(jì)的專用工具，在卵母細(xì)胞和胚胎冷凍方面迅速得到推廣應(yīng)用，卵母細(xì)胞冷凍效率不僅得到較大提高，而且解凍后的卵母細(xì)胞質(zhì)量較常規(guī)細(xì)管法明顯增強(qiáng)[12]。OPS法由于具有虹吸作用，卵母細(xì)胞的裝載時(shí)間相對縮短，與常規(guī)細(xì)管法相比不僅提高了冷凍和解凍的速度，同時(shí)減少了透明帶的損傷和滲透損傷[13]。CPS法與OPS法相似，研究表明，二者冷凍效率也沒有較大差異[14，15]。GMP法是在OPS法的原理上衍生而來的，只不過是將塑料吸管換成玻璃毛細(xì)管，由于其內(nèi)徑較小，同樣長度的玻璃毛細(xì)管拉長后容積約為OPS管的1/19，因此，GMP法比OPS法具有更快的冷凍速率，且由于比重較大不會(huì)漂浮在液氮中[16]。

2.3 冷凍環(huán)

冷凍環(huán)是直徑0.5mm～0.7mm的尼龍環(huán)，冷凍卵母細(xì)胞之前，在冷凍環(huán)上用冷凍液制作一層薄膜，然后將卵母細(xì)胞小心移到冷凍液薄膜上，這個(gè)過程較為精細(xì)，要求盡量減少冷凍液的同時(shí)將卵母細(xì)胞放置在薄膜上，然后迅速投入液氮中[17]。由于沒有細(xì)管等的隔離，而且冷凍液量少，冷凍解凍過程中溫度變化速度既迅速又均勻，能夠有效減少細(xì)胞的機(jī)械和滲透損傷[18]。如果長期保存卵母細(xì)胞，可以將冷凍環(huán)插入帶有磁性的冷凍帽上，放入液氮預(yù)冷的配套冷凍管中，這個(gè)冷凍管開口端帶有鐵圈，能夠有力吸住磁性冷凍帽，而且冷凍管底部有透氣孔，利于液氮迅速進(jìn)入冷凍管。冷凍環(huán)法較之OPS法所需冷凍液更少，因此冷凍速率更快，其冷凍效果更佳[19]。

3 抗凍保護(hù)劑

抗凍保護(hù)劑是在冷凍液中添加的主要為了防止細(xì)胞冷凍損傷的物質(zhì)，主要分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑2種。滲透性保護(hù)劑主要有乙二醇、甘油、丙二醇、二甲基亞砜、丁二醇、乙酰胺等。這類抗凍保護(hù)劑能夠使細(xì)胞迅速脫水，同時(shí)能夠降低冷凍液的凝固點(diǎn)，從而減少細(xì)胞內(nèi)形成冰晶而造成對各種細(xì)胞器機(jī)械損傷[20]。非滲透性保護(hù)劑主要包括葡萄糖、果糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖等小分子量糖類，同時(shí)也包括大分子量的聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、聚乙二醇等物質(zhì)。這類抗凍保護(hù)劑能夠增加并穩(wěn)定細(xì)胞外冷凍液的滲透壓，從而在外部達(dá)到細(xì)胞脫水目的的同時(shí)降低滲透損傷，并且可以降低滲透性抗凍保護(hù)劑的濃度，減少毒性損傷[21]。

在眾多抗凍保護(hù)劑中，最常用的主要是甘油、二甲基亞砜、蔗糖、海藻糖等物質(zhì)。海藻糖是由2個(gè)葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，在冷凍液中添加后由于其熱穩(wěn)定性好而使玻璃化效果溫域增長，同時(shí)對卵母細(xì)胞的滲透保護(hù)作用被人們廣泛接受，應(yīng)用較為廣泛[22]。

4 卵母細(xì)胞體積調(diào)控

在卵母細(xì)胞玻璃化凍融過程中，由于細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓差的存在，會(huì)造成卵母細(xì)胞因快速脫水或充水體積急劇皺縮或膨脹，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞的透明帶斷裂、紡錘體失常、細(xì)胞骨架損傷、功能分子平衡破壞等[23]。卵母細(xì)胞在凍融過程中受滲透壓影響而體積變化后，滲透壓調(diào)節(jié)分子通道會(huì)被激活，通過提高細(xì)胞內(nèi)無機(jī)離子和有機(jī)滲透壓而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)部分子的濃度，使卵母細(xì)胞達(dá)到正常體積[24]。近年來，通過調(diào)控卵母細(xì)胞體積、減少凍融過程中的滲透損傷來提高其冷凍效率的研究日益受到關(guān)注。Moawad等[25]在解凍后的胚胎培養(yǎng)液中添加滲透壓調(diào)節(jié)分子L-膽堿，顯著提高了小鼠卵母細(xì)胞凍融后的體外受精率和胚胎體外發(fā)育率，說明滲透壓對卵母細(xì)胞的影響不僅存在于凍融過程中，其調(diào)節(jié)作用至少能夠持續(xù)到解凍后受精及其后的胚胎發(fā)育階段。

5 展望

近年來，卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)研究雖然得到了很大的進(jìn)展，但是仍然難以擺脫滲透性抗凍保護(hù)劑細(xì)胞毒性的困擾，在冷凍載體上難以達(dá)到量產(chǎn)推廣的程度，凍融后的卵母細(xì)胞發(fā)育潛力還有提高的空間。相信在不久的將來，細(xì)胞體積調(diào)控理論能夠得到豐富，更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠被開發(fā)應(yīng)用為抗凍保護(hù)劑，卵母細(xì)胞冷凍保存效率會(huì)得到進(jìn)一步提高，從而為人類生殖醫(yī)學(xué)、胚胎生物工程和動(dòng)物種質(zhì)資源保存提供有力支撐和巨大的推動(dòng)作用。

[1]CLARK N A,SWAIN J E.Oocyte cryopreservation:searching for novel improvement strategies[J].Journal of assisted reproduction and genetics,2013,30(7):865-875.

[2]HOSSEINI S M,ASGARI V,OSTADHOSSEINI S,et al.Developmental competence of ovine oocytes after vitrification: differential effects of vitrification steps,embryo production methods,and parental origin of pronuclei[J].Theriogenology,2015,83(3):366-376.

[3]FUKU E,KOJIMA T,SHIOYA Y,et al.In vitro fertilization and development of frozen-thawed bovine oocytes[J].Cryobiology,1992,29(4):485-492.

[4]SUZUKI T,BOEDIONO A,TAKAGI M,et al.Fertilization and development of frozen-thawed germinal vesicle bovine oocytes by a one-step dilution method in vitro[J].Cryobiology,1996,33(5):515-524.

[5]LIM J M,FUKUI Y,ONO H.Developmental competence of bovine oocytes frozen at various maturation stages followed by in vitro maturation and fertilization[J].Theriogenology,1992,37(2):351-361.

[6]OTOI T,YAMAMOTO K,KOYAMA N,et al.In Vitro Fertilization and Development of Immature and Mature Bovine Oocytes Cryopreserved by Ethylene Glycol with Sucrose[J].Cryobiology,1995,32(5):455-460.

[7]李梅,陳子江,李媛,等.慢速冷凍對人成熟卵與未成熟卵發(fā)育潛能的影響 [J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2003,19(3):147-149,209.

[8]NAGY Z P,NEL-THEMAAT L,CHANG C C,et al.Cryopreservation of eggs[J].Methods in molecular biology,2014,1154:439-454.

[9]王彩玲,張華智,李智方,等.蔗糖和海藻糖對水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保護(hù)效果的比較 [J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015,34(1):53-59.

[10]楊云,周新麗,周楠峰,等.卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)新進(jìn)展[J].生殖與避孕,2015,35(03):179-184,95.

[11]李林鳳,關(guān)偉軍,馬月輝,等.卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2006,33(5):28-30.

[12]ZHOU X L,AL NAIB A,SUN D W,et al.Bovine oocyte vitrification using the Cryotop method:effect of cumulus cells and vitrification protocol on survival and subsequent development[J].Cryobiology,2010,61(1):66-72.

[13]丁志麗,桑林華,王杏龍.哺乳動(dòng)物胚胎冷凍保存的研究進(jìn)展[J].河南畜牧獸醫(yī),2004,25(3):9-10.

[14]李娜,姚軍.不同冷凍方法對小鼠卵母細(xì)胞凍存的影響[J].長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,29(1):14-16.

[15]SPRICIGO J F,MORAIS K,FERREIRA A R,et al.Vitrification of bovine oocytes at different meiotic stages using the Cryotop method:assessment of morphological,molecular and functional patterns[J].Cryobiology,2014,69(2):256-265.

[16]MORATO R,IZQUIERDO D,PARAMIO M T,et al.Cryotops versus open-pulled straws(OPS)as carriers for the cryopreservation of bovine oocytes:effects on spindle and chromosome configuration and embryo development[J].Cryobiology,2008,57(2):137-141.

[17]ZANDER-FOX D,CASHMAN K S,LANE M.The presence of 1mm glycine in vitrification solutions protects oocyte mitochondrial homeostasis and improves blastocyst development[J].Journal of assisted reproduction and genetics,2013,30(1):107-116.

[18]GARDNER D K,SHEEHAN C B,RIENZI L,et al.Analysis of oocyte physiology to improve cryopreservation procedures[J].Theriogenology,2007,67(1):64-72.

[19]陶志云,陶勇,章孝榮.豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2007,(1):50-53.

[20]王軍,孫博,呂文發(fā).哺乳動(dòng)物胚胎冷凍保存研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(34):11107-11109.

[21]AMSTISLAVSKY S Y,BRUSENTSEV E Y,OKOTRUB K A,et al.Embryo and gamete cryopreservation for genetic resources conservation of laboratory animals[J].Russian Journal of Developmental Biology,2015,46(2):47-59.

[22]ETO T,TAKAHASHI R,KAMISAKO T.Strain preservation of experimental animals:vitrification of two-cell stage embryos for multiple mouse strains[J].Cryobiology,2015,70(2):150-155.

[23]REED M L,SAID A H,THOMPSON D J,et al.Large-volume vitrification of human biopsied and non-biopsied blastocysts:a simple,robust technique for cryopreservation[J].Journal of assisted reproduction and genetics,2015,32(2):207-214.

[24]ZHOU C,BALTZ J M.JAK2 mediates the acute response to decreased cell volume in mouse preimplantation embryos by activating NHE1[J].Journal of cellular physiology,2013,228(2):428-438.

[25]MOAWAD A R,TAN S L,XU B,et al.L-carnitine supplementation during vitrification of mouse oocytes at the germinal vesicle stage improves preimplantation development following maturation and fertilization in vitro[J].Biology of reproduction,2013,88(4):104.