，，，，，

（1.廣西柳州市柳北區(qū)動物疫病預防控制中心，廣西 柳州 545002；2.廣西柳州市柳北區(qū)水產畜牧獸醫(yī)局，廣西 柳州 545002；3.廣西柳州市柳北區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西 柳州 545002；4.廣西柳州市動物疫病預防控制中心，廣西 柳州 545005）

禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗與重組禽流感滅活疫苗組合免疫效果觀察

楊飛燕1，劉 穎1，張 廉1，陸成春2，雷 振3，許宗麗4

（1.廣西柳州市柳北區(qū)動物疫病預防控制中心，廣西 柳州 545002；2.廣西柳州市柳北區(qū)水產畜牧獸醫(yī)局，廣西 柳州 545002；3.廣西柳州市柳北區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣西 柳州 545002；4.廣西柳州市動物疫病預防控制中心，廣西 柳州 545005）

為進一步了解、掌握禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗及與重組禽流感滅活疫苗組合使用的免疫效果，本研究以麻花雞作為試驗對象，制定了4種不同的免疫程序，分別對4組試驗雞群進行免疫，通過測定各組雞只產生的免疫抗體效價和免疫抗體合格率，以評價二聯(lián)活疫苗及與禽流感滅活疫苗的免疫效果。試驗結果表明：禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗單獨用于肉雞禽流感H5免疫預防抗體效價低于4 log2；建議禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗可以與重組禽流感病毒滅活疫苗組合使用，兩種疫苗免疫時間間隔2周左右，以免抑制機體產生對新城疫的免疫應答。

禽流感；新城疫；重組二聯(lián)活疫苗；重組禽流感滅活疫苗；抗體效價；抗體合格率

世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的A類傳染病中，禽類烈性傳染病只有兩種，分別是高致病性禽流感和新城疫[1]。使用禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗可一次完成高致病性禽流感和新城疫的免疫，收到一種疫苗預防兩種重大疫病的效果。禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗是以新城疫Lasota弱毒病毒為載體，將禽流感H5的HA基因片段插入到Lasota載體中制作的疫苗，是更為新型的負鏈RNA病毒活載體疫苗，其生產技術在國際上具有領先水平[2]。

目前在基層動物防疫，特別是在農村散養(yǎng)戶家禽防疫中普遍使用的禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗方便、省事，很受村級動物防疫員和農戶的歡迎。但按照該疫苗的使用說明，生產實踐中單獨使用該疫苗所取得的禽流感免疫效果并不理想。2012年柳州市重大動物疫病防控驗收工作時，特意挑選轄區(qū)內2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)2個村屯共20只二次免疫了禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗的散養(yǎng)家禽，供采血檢測禽流感和新城疫抗體。結果顯示禽流感平均免疫抗體為＜1log2，平均合格率為0；新城疫平均免疫抗體為7log2，平均合格率為85%。為了進一步了解、掌握單獨使用禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗的免疫效果，以及與禽流感滅活疫苗聯(lián)合使用的免疫效果，本研究以麻雞作為試驗對象，制定4種不同免疫程序，分別用于4組試驗雞群。通過應激反應觀察、抗體效價檢測、抗體合格率等參數(shù)，以評價二聯(lián)活疫苗及與禽流感滅活疫苗的實際免疫效果，探索免疫方案，指導免疫工作，為禽流感、新城疫的預防和控制工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗疫苗 禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）（AI-ND），哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司，生產批號2013111；重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型Re-6株）（AI），廣東永順生物制藥股份有限公司，生產批號2013045；新城疫滅活油乳劑疫苗（ND），廣東大華農動物保健品股份有限公司，生產批號190032008。

1.1.2 試驗動物 15日齡麻花雞，由柳州市柳北區(qū)順發(fā)禽苗經營部提供。

1.1.3 診斷試劑 哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司生產的禽流感H5（Re-6）株抗原，批號2013003，有效期2年；禽流感H5陽性血清，批號2013002，有效期2年；哈爾濱生物制品國家工程研究中心有限公司生產的新城疫抗原，批號14M001，有效期2年；新城疫陽性血清，批號14M001，有效期2年；紅細胞懸液采自農戶非免疫雞血清，按常規(guī)方法制備成1%懸液。

1.1.4 其它藥品器材 5g/L滅菌生理鹽水、抗凝劑、微量移液器、離心機、96孔V型板等。

1.2 方法

1.2.1 試驗方案 本次試驗于2014年3月-6月在柳州市柳北區(qū)順發(fā)禽苗經營部提供的養(yǎng)殖場內進行，試驗設試驗組和對照組，試驗組又分4個小組，每組40只雞，分別圈養(yǎng)（表1）。

表1試驗方案

1.2.2 血清樣本采集 疫苗接種后以一定間隔時間每組隨機采樣10～12份，檢測禽流感H5和新城疫抗體。禽流感H5抗體按照GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術-血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗進行檢測；新城疫抗體按照GB16550-2008新城疫診斷技術-血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗進行檢測。

2 結果與分析

2.1 雞群免疫后應激反應情況 試驗1組、2組、3組應激反應較輕，僅僅表現(xiàn)為采食量減少，2～3d后就恢復正常；試驗4組應激反應較大，表現(xiàn)為采食量減少，少部分雞只食欲不振，腳軟，死亡率5%左右。

2.2 各組試驗雞抽樣檢測禽流感H5抗體和新城疫抗體效價（表2、表3和圖1、圖2）。

表2 禽流感H5抗體合格率和抗體效價（單位：%、log2）

表3新城疫抗體合格率和抗體效價（單位：%、log2）

圖1 各組禽流感H5抗體效價對比圖

圖2 各組新城疫抗體效價對比圖

2.3 試驗1組中二次免疫禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗，結果表明：二聯(lián)活疫苗刺激肉雞產生的禽流感H5抗體效價和抗體合格率均較低，最高分別只有1.6 log2和20%，達不到有效保護；新城疫抗體效價和抗體合格率則較高，峰值達到7.3log2和100%，但維持時間較短。這與我們2012年重大動物疫病防控驗收抽檢的20只散養(yǎng)戶家禽的抗體效價基本一致（圖1、圖2、圖3）。其原因不得而知，據(jù)有關資料介紹：禽流感病毒和新城疫病毒均具有血凝素，且均為保護性抗原，在同一個載體上同時具有兩種血凝素抗原需要結合到受體位點上，即在免疫應答時是否存在兩種血凝素抗原位點需要競爭性結合血凝素受體位點，而新城疫的血凝素受體位點借助于自身病毒空間結構優(yōu)勢，比禽流感的H5血凝素結合受體位點更具有優(yōu)勢[3]。

2.4 試驗2組中第一次免疫禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗，第二次分別免疫重組禽流感病毒滅活苗和新城疫油苗。結果表明：二次免疫后7天即37日齡就開始產生禽流感抗體效價，45日齡達到峰值9.1log2，并能維持一個月左右時間的較高抗體滴度，抗體合格率也隨著抗體效價的升高而升高，最高達到100%；二次免疫新城疫油苗后1周抗體效價會有所下降，之后就持續(xù)上升，最高抗體效價于63日齡出現(xiàn)，為8.4log2，維持時間也較長?？贵w合格率于45日齡達到100%，之后一直維持高抗體合格率（圖1、圖2、圖4）。滅活疫苗具有比較穩(wěn)定及誘導產生的抗體水平均一等優(yōu)點，但其存在接種后產生應答的潛伏期相對較長，成本偏高等不足[1]。本組試驗雞分別接種禽流感滅活疫苗和新城疫油苗，都產生了較高水平且均一的抗體效價，進一步驗證了滅活疫苗比較穩(wěn)定、誘導產生的抗體水平均一等優(yōu)良的特性。

2.5 試驗3組中第一次免疫禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗，第二次免疫重組禽流感病毒滅活苗。結果表明：禽流感抗體滴度與試驗2組基本一致，峰值達到8.8 log2，并能維持較長時間，抗體合格率也較高。新城疫抗體滴度于37日齡達到峰值6.8 log2，之后就緩慢下降，53日齡后低于5 log2，維持時間較短，抗體合格率也于53日齡后降到70%以下（圖1、圖2、圖5）。

2.6 試驗4組中第一次和第二次都是同時免疫禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗和重組禽流感病毒滅活苗。結果表明：禽流感抗體滴度于第一次免疫后1周即22日齡呈緩慢上升趨勢，到第二次免疫日齡即30日齡時平均抗體滴度達到3.5 log2，二免后2周即45日齡達到峰值7.9 log2，并能維持較長時間。抗體合格率37日齡后達到100%，最低也能達到70%以上；新城疫抗體效價卻很低，最高也只有4.3 log2，平均抗體合格率33%，達不到國家對新城疫免疫的要求（圖1、圖2、圖6）。試驗結果與司興奎等[4]研究的結論基本一致，重組禽流感滅活苗與禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗同時接種可抑制機體產生對新城疫的免疫應答，但具體機制尚需進一步研究。

圖3 試驗1組禽流感抗體效價和新城疫抗體效價結果比較

圖4 試驗2組禽流感抗體效價和新城疫抗體效價結果比較

圖5 試驗3組禽流感抗體效價和新城疫抗體效價結果比較

圖6 試驗4組禽流感抗體效價和新城疫抗體效價結果比較

3 小結與討論

3.1 本試驗用禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）單獨免疫，以及與重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型Re-6株）組合采用不同的免疫方法接種商品肉雞，結果提示，禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）單獨用于肉雞禽流感H5免疫預防抗體效價低于4 log2。據(jù)有關資料介紹，禽流感最低保護臨界值為4 log2-6 log2之間，且必須大于4 log2[5]，重組二聯(lián)苗免疫保護的臨界值為3 log2左右[6]。如果雞群抗體效價長期低于4 log2，就不能實現(xiàn)有效保護。有研究以雞痘病毒為載體表達H5亞型禽流感病毒HA基因的重組疫苗接種SPF雞的試驗結果免疫后抗體滴度也較低，但通過攻毒試驗，仍能夠抵御同亞型禽流感病毒的致死性攻擊，保護效果達到或優(yōu)于滅活苗[7]。禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）是否也存在這種情況，未見相關報道。限于實際條件，未能開展強毒攻擊保護試驗，對此需進一步研究證實。

3.2 根據(jù)本次試驗的結果，建議禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）與重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型Re-6株）組合使用，以增強機體對禽流感的免疫應答強度。但兩種疫苗免疫時間最好間隔2周左右，以免抑制機體產生對新城疫的免疫應答。

3.3 本次試驗中禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）免疫后產生的新城疫抗體迅速、效價較高，但維持時間不長，這也驗證了活疫苗免疫后群體抗體水平不均一和穩(wěn)定性差等缺點的特性。建議在臨床生產中禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rLH5-6株）做新城疫基礎免疫后，間隔一段時間后要加強新城疫的免疫，以保證確切的新城疫免疫效果。

[1] Saif YM，et al//蘇敬良，高福，索勛，等譯.禽病學[M].第11版.中國農業(yè)出版社，2005：66-93，147-177.

[2] 林永堅，關建新，袁海峰，等.快大型商品肉雞禽流感母源抗體的監(jiān)測及禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗配合禽流感滅活疫苗免疫雞只的效果觀察[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（11）：99-101.

[3] 陸桂麗，汪萍，沙依蘭古麗.等.禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5株）接種肉雞后免疫抗體水平消長規(guī)律分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（12）：39-42.

[4] 司興奎，陳建紅，張濟培.新城疫-禽流感重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5株）的免疫效果分析[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2007，32（3）：24-28.

[5] 吳庭才，張春杰，郭向鵬.禽流感母源抗體消長規(guī)律和免疫保護抗體臨界值的測定[J].河南科技大學學報（農學版），2002，22（4）：243-244.

[6] 曹立輝，盧冬梅，李秀英，等.禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5株）對商品肉雞的免疫效果觀察[J].中國家禽，2011，33（4）：61-62.

[7] 賈立軍，張艷梅，李軍偉，等.H5亞型禽流感重組雞痘病毒活載體疫苗的免疫效力[J].揚州大學學報（農業(yè)與生命科學版），2003，24（2）：11-13.

Analysis of Immune Effects of Recombinant Live AI-ND Vaccine and Recombinant Inactivated AI Vaccine in Chickens

Yang Feiyan1，Liu Ying1，Zhang Lian1，Lu Chengchun2，Lei Zhen3，Xu Zongli4Liubei Animal Disease Prevention and Control Center，Liuzhou，Guangxi 545002；2. Liubei Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Liuzhou，Guangxi 545002；3. Liubei Animal Health Supervision Institute，Liuzhou，Guangxi 545002；4. Liuzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Liuzhou，Guangxi 545005）

In order to compare the immune results of recombinant live avian inf uenza and Newcastle disease（AIND） and recombinant inactivated avian inf uenza vaccine（AI） in chickens，4 different immunization procedures were conducted respectively over 4 test groups for evaluation of immune effects of recombinant live AI-ND vaccine and recombinant inactivated AI vaccine through examination of immune antibody titer and yield in the 4 test groups. The test results showed that：when the recombinant live AI-ND vaccine was used alone，the H5 AI immune antibody titer in broilers was less than 4log2. It was recommended that live AI-ND vaccine and inactivated AI vaccine should be used in combination with 2 weeks interval without inhibiting the immune response to Newcastle disease vaccine.

avian influenza；Newcastle disease；recombinant live AI-ND vaccine；recombinant inactivated AI vaccine；antibody titer；antibody qualif cation rate

S852.65

：B

：1005-944X（2015）01-0074-05