歐金梅,儲(chǔ)曉琴,2,張 虹
(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012)
木通始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有利尿通淋、清心除煩、通經(jīng)下乳的功效[1]。《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定,木通的來源為木通科木通Akebia quinata(Thunb.)Decne.、三 葉 木 通Akebia trifoliate(Thunb.)Koidz.和 白 木 通Akebia trifoliate(Thunb.)Koidz.var.australis(Diels)Rehd.的藤莖[2],有效成分為木通苯乙醇苷B、齊墩果酸、常春藤皂苷元等[3]。木通產(chǎn)于長(zhǎng)江流域各省區(qū),在日本和朝鮮有分布,長(zhǎng)期依賴野生資源,量少不能滿足市場(chǎng)需要,因此藥材市場(chǎng)及醫(yī)院多以川木通代替木通使用。在第四次全國(guó)中藥資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn),木通、三葉木通在安徽有分布,木通主要分布在明光、滁州、巢湖、青陽、寧國(guó)等江淮丘陵及皖南山區(qū),資源豐富;三葉木通主要分布在寧國(guó)、黃山、歙縣等皖南山區(qū)。如能進(jìn)一步開發(fā)利用,可解決市場(chǎng)上木通藥材緊缺的問題。
本實(shí)驗(yàn)以安徽產(chǎn)木通為對(duì)象,通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4-10],采用高效液相色譜法測(cè)定木通中木通苯乙醇苷B、齊墩果酸、常春藤皂苷元的含量,并與市售湖北產(chǎn)木通及川木通進(jìn)行比較,以期為安徽產(chǎn)木通的質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。
1.1 儀器 AG285電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;LC-20AB高效液相色譜儀(包括SPD-M20A紫外檢測(cè)器、LC-20AB高壓輸液泵、LC-solution色譜工作站):日本島津;HH-S2系列恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;雙層鐵皮電爐:上海日用電爐廠;KQ-100DB數(shù)控超聲儀:江蘇省昆山超聲儀器有限公司;SF-130C萬能粉碎機(jī):湖南省吉首市中湘制藥機(jī)械廠。
1.2 試劑 齊墩果酸(批號(hào)110709,純度≥98%):中國(guó)食品藥品檢定研究院;常春藤皂苷元(批號(hào)111733,純度≥98.3%):中國(guó)食品藥品檢定研究院;木通苯乙醇苷B(批號(hào)FY19730401,純度≥98%):江蘇省南通飛宇生物科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純;水為純凈水;其余試劑均為分析純。木通藥材采集或購買,產(chǎn)地為安徽、湖北、四川,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)周建理教授鑒定為木通科木通、三葉木通。
2.1 木通苯乙醇苷B含量測(cè)定
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定木通苯乙醇苷B標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg于50 m L容量瓶中,70%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,過濾,即得0.04 mg/m L的對(duì)照品溶液。
2.1.2 供試品溶液的制備 稱取藥材粉末(過4號(hào)篩)約0.5 g,精密稱定,置于50 m L的平底燒瓶中,加70%甲醇25 m L,回流45 min后放至室溫,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,過濾。精密移取續(xù)濾液4 m L至100 m L容量瓶中,70%甲醇定容,過濾,即得。
2.1.3 色譜條件 色譜柱:Alltima C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-水-磷酸(35∶65∶0.05);流速:1.0 m L/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm。對(duì)照品和木通藥材的高效液相色譜圖見圖1。
2.1.4 線性關(guān)系考察 按上述色譜條件,將對(duì)照品稀釋成0.004 4、0.008 8、0.013 2、0.022 0、0.030 8、0.035 2 mg/m L等一系列濃度,依次進(jìn)樣。結(jié)果表明木通苯乙醇B在0.004 4~0.035 2 mg/m L濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=2.734 4x+59 146,r=0.999 3。
2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液,在上述色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,其RSD為0.95%。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取三葉木通(安徽歙縣)粉末,約0.5 g,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣分析,其峰面積 RSD為1.39%,表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取三葉木通(安徽歙縣)粉末,約0.5 g,共6份,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品,在上述色譜條件下測(cè)定,木通苯乙醇苷B峰面積RSD為1.43%。
2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的三葉木通粉末6份,每份0.2 g,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品,分別加入一定量的木通苯乙醇苷B對(duì)照品,測(cè)定并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果木通苯乙醇苷B的平均回收率為97.05%,RSD為1.20%。
2.1.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地的木通粉末各0.5 g,精密稱定,按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作,在上述色譜條件下測(cè)定,計(jì)算不同來源的木通藥材中木通苯乙醇苷B的含量,測(cè)定結(jié)果見表1。
2.2 齊墩果酸和常春藤皂苷元含量測(cè)定[11-12]
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定齊墩果酸和常春藤皂苷元對(duì)照品各2.0 mg,置2 m L容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得含齊墩果酸1.15 mg/m L、常春藤皂苷元1.1 mg/m L的對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備 將木通藥材(過4號(hào)篩)2 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入甲醇50 m L,超聲提取30 min,過濾,并用適量甲醇洗滌殘?jiān)喜V液與洗液,水浴蒸干,殘?jiān)?0 m L水溶解,用水飽和正丁醇萃取3次,合并萃取液,蒸干,殘?jiān)蛹状?0 m L、40%鹽酸2 m L,加熱回流4 h,水解產(chǎn)物加水10 m L,用三氯甲烷萃取3次,合并濾液,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?,并定容?0 m L容量瓶中,搖勻即得。
2.2.3 色譜條件 色譜柱:Alltima C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-水(65∶35);流速:1.0 m L/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm。對(duì)照品和木通藥材的高效液相色譜圖見圖2。
2.2.4 線性關(guān)系考察 按上述色譜條件,齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品制成0.145、0.233、0.330、0.460、0.580、0.600 mg/m L,常春藤皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品制成 0.21、0.33、0.42、0.60、0.70、0.84 mg/m L 等一系列濃度,依次進(jìn)樣。結(jié)果表明,齊墩果酸在0.145~0.60 mg/m L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=5 992.4x+5.0×105,r=0.999 0。常春藤皂苷元在0.008 4~0.033 6 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=7 108.8x+8.8×105,r=0.999 5。
2.2.5 精密度試驗(yàn) 取1.15 mg/mL齊墩果酸,1.1 mg/mL常春藤皂苷元對(duì)照品溶液,按上述色譜條件,進(jìn)樣40μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。齊墩果酸和常春藤皂苷元峰面積的RSD分別為1.93%、1.34%。
2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取木通(安徽青陽)粉末,約2 g,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品,分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣分析,分別測(cè)得齊墩果酸和常春藤皂苷元峰面積的RSD為1.97%、1.67%,表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取木通(安徽青陽)藥材粉末,約2 g,共6份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品,在上述色譜條件下測(cè)定,齊墩果酸和常春藤皂苷元的 RSD分別是1.19%、1.33%。
2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定取已知含量的木通粉末,約2 g,共6份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品,精確加入一定量的齊墩果酸對(duì)照品和常春藤皂苷元對(duì)照品,測(cè)定并計(jì)算加樣回收率,結(jié)果齊墩果酸平均回收率為95.43%(RSD=2.00%),常春藤皂苷元平均回收率為95.04%(RSD=2.06%)。
2.2.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地的木通各2 g,精密稱定,按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作,在上述色譜條件下測(cè)定,計(jì)算不同來源的木通藥材中齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量,測(cè)定結(jié)果見表1。
表1 不同產(chǎn)地木通中木通苯乙醇苷B、齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量
3.1 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)中選擇乙腈-水(65∶35)為齊墩果酸和常春藤皂苷元的流動(dòng)相,其中乙腈能夠很好地將兩個(gè)成分洗脫并使兩個(gè)成分得到良好的分離。
3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果齊墩果酸和常春藤皂苷元在205 nm處有最大吸收,但干擾較大,經(jīng)試驗(yàn)選擇203 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。而木通苯乙醇苷B在330 nm處有最大吸收,且干擾少。
3.3 多種有效成分含量測(cè)定 《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定木通的指標(biāo)性成分為木通苯乙醇苷B,但單一成分往往不能全面評(píng)價(jià)一味中藥的藥效,因此,筆者結(jié)合文獻(xiàn)增加了木通中齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量測(cè)定,能更全面地評(píng)價(jià)木通藥材的質(zhì)量。
含量測(cè)定結(jié)果表明,安徽寧國(guó)及明光產(chǎn)木通中有效成分木通苯乙醇苷B、齊墩果酸和常春藤皂苷元成分含量高于市售木通,如能進(jìn)行深入研究,擴(kuò)大木通藥材的產(chǎn)地及產(chǎn)量,滿足市場(chǎng)需求,可解決市場(chǎng)上因正品木通來源不足而導(dǎo)致混用品繁雜的問題。
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