樊志強(qiáng)，廖立新，張友來(lái)，羅 飛（.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科 330000；.廈門大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科 36003）

病理性瘢痕的形成是創(chuàng)傷過(guò)度反應(yīng)的結(jié)果［1］，病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其組織性特征是持續(xù)且大量增生的成纖維細(xì)胞，炎性生長(zhǎng)因子活化所產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的沉積，其影響愈合后的外觀和功能。增生性瘢痕形成是個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，其中細(xì)胞移行、肉芽組織的形成、新生血管及基質(zhì)的重塑均依賴ECM（膠原、纖維粘連蛋白、彈性蛋白等）的分泌和降解［2］。其中膠原的產(chǎn)生是增生性瘢痕形成的決定性因素［3］，膠原的降解主要依賴基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），MMPs由結(jié)締組織及腫瘤組織合成分泌。膠原酶家族中MMP-2、MMP-9是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。胸腺素β4有顯著的促進(jìn)皮膚愈合的作用，Philp等［4］曾在大鼠皮膚創(chuàng)傷模型中應(yīng)用胸腺素β4發(fā)現(xiàn)多個(gè)MMPs表達(dá)量在成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞中顯著增加，加速了創(chuàng)面愈合的過(guò)程。但對(duì)于胸腺素β4對(duì)人的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中MMPs的影響研究較少，本研究擬了解胸腺素β4對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 取2013年6～9月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科手術(shù)切取的增生性瘢痕組織，于－70℃冰箱中凍存待用。診斷標(biāo)準(zhǔn)：瘢痕疙瘩為損傷后，瘢痕生長(zhǎng)超出原有范圍向周圍正常皮膚組織浸潤(rùn)擴(kuò)大，病程超過(guò)12個(gè)月，持續(xù)增生，并有規(guī)則贅生物，高出皮膚表面，呈蟹足樣生長(zhǎng)，伴瘙癢和刺痛。同時(shí)根據(jù)病史、病變過(guò)程、局部刺激因素進(jìn)行綜合判斷。增生性瘢痕均系嚴(yán)重?zé)齻缶植吭錾?，具有隆起、形狀不?guī)則、質(zhì)地實(shí)韌、常伴疼痛，于傷口愈合后6～12個(gè)月取材。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前應(yīng)用激素治療及接受放射治療的患者。其中男6例、女3例，患者年齡25～53歲，平均34.5歲。均已告知患者及家屬，并簽知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自 Hy－Clone公司；胸腺素β4粉劑購(gòu)自Prospec公司，考馬斯亮藍(lán)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào) KR106-02）、2×Taq PCR Master Mix（貨號(hào)KT201）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；MMP-2單克隆抗體（貨號(hào)ab7033）、MMP-9單克隆抗體（貨號(hào)ab137867）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；人β-actin抗體（貨號(hào) TA-09）購(gòu)自中杉金橋；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。引物：MMP-2上游5′-CAG GGA ATG AGT ACT GGG TCT ATT-3′，下游5′-ACT CCA GTT AAA GGC AGC ATC TAC-3′；MMP-9 上 游 5′-AAT CTC TTC TAG AGA CTG GGA AGG AG-3′，下游5′-AGC TGA TTG ACT AAA GTA GCT GGA-3′；β-actin 上 游 5′-GAG CTA CGA GCT GCC TGA CG-3′，下游 5′-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GG-3′；引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng) 采用組織塊法培養(yǎng)，將臨床標(biāo)本在無(wú)菌條件下用D-Hank′s液反復(fù)沖洗并消毒，切成約1 mm3的塊狀，種植于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，間隔約0.3cm。接種好后靜置數(shù)分鐘，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)。置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，根據(jù)生長(zhǎng)情況每3～5天換液，待原代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%時(shí)消化傳代，本實(shí)驗(yàn)選用第3～6代細(xì)胞。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)胸腺素β4濃度不同分為對(duì)照組（0 μg／m L）和實(shí)驗(yàn)組（0.05、0.1、1.0、5.0μg／mL）。

1.5 RT-PCR檢測(cè) MMP-2、MMP-9基因表達(dá)的變化 取第3～6代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)，移種到6孔板，經(jīng)24h饑餓培養(yǎng)后逐一加藥。藥物干預(yù)6h后，通過(guò)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分析所提取的總RNA的完整性和濃度。采用北京天根公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，并在BLAST中進(jìn)行同源性比較。PCR的條件為：變性94℃3min；94℃30s；60℃30s，72℃10min 29個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5μL，在1.5%瓊脂糖中電泳后，凝膠圖像分析系統(tǒng)Bio-Rad Image Lab對(duì)目的基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行灰度測(cè)定?；虮磉_(dá)量是以基因的灰度值與β-actin基因的灰度值的比值表示。

1.6 Western blot檢測(cè) MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)變化藥物處理后提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)溶液對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。采用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，凝膠經(jīng)半干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，轉(zhuǎn)移好的NC膜用5%脫脂奶粉封閉1h。一抗4℃孵育過(guò)夜，充分漂洗后，二抗4℃孵育4h，洗膜3次，最后用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)，膠片曝光，顯影，定影。蛋白的表達(dá)量以該蛋白的灰度值與β-actin蛋白的灰度值的比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS9.2軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析模型，模型的R Squared較高，提示模型有意義，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)變化 成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)后第4天從組織塊邊緣游出，較稀疏（圖1A），第7天呈大片密集生長(zhǎng)，呈放射狀梭形排列，細(xì)胞體飽滿（圖1B）。傳代后細(xì)胞呈旋渦狀或條索狀（圖1C）。胸腺素β4干預(yù)后部分細(xì)胞開(kāi)始變圓，細(xì)胞間隙增大，數(shù)量減少，部分凋亡飄?。▓D2B、C），而對(duì)照組無(wú)明顯變化（圖2A）。

圖1 傳代成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀況（×100）

圖2 胸腺素β4干預(yù)后細(xì)胞生長(zhǎng)狀況（×100）

2.2 胸腺素β4對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分泌 MMP-2、MMP-9的影響 胸腺素β4能夠提升 MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白的表達(dá)，0.05、0.1、1.0、5.0μg／mL實(shí)驗(yàn)組中 MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白含量均高于對(duì)照組，分別以1.0、5.0 μg／mL組作用最明顯，見(jiàn)圖3、4。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析模型，模型的R Squared較高，提示模型有意義。單因素方差分析結(jié)果顯示，不同濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)值分別為279.55，207.47，56.32，88.52，P＜0.01。組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，結(jié)果提示濃度越高，表達(dá)量越高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 Western blot和RT-PCR檢測(cè)胸腺β4作用后增生性瘢痕組織MMP-2、MMP-9與對(duì)照組表達(dá)差異

圖4 RT-PCR檢測(cè) MMP-2、MMP-9蛋白在各組織中的含量

圖4 Western blot檢測(cè) MMP-2、MMP-9蛋白在各組織中的含量

3 討 論

增生性瘢痕的形成是一個(gè)較為復(fù)雜的病理過(guò)程，正常情況下，傷口預(yù)后愈合過(guò)程中ECM沉積和降解處于動(dòng)態(tài)平衡中，研究顯示膠原合成和降解是影響創(chuàng)面愈合和后期組織重塑的重要因素［5］，有相關(guān)研究證實(shí)在后期瘢痕形成過(guò)程中成纖維細(xì)胞膠原合成明顯增高，同時(shí)合成的膠原纖維排列明顯紊亂［6］。保持ECM合成和降解之間的平衡對(duì)完成組織修復(fù)有重要作用，膠原的降解主要是通過(guò)酶促反應(yīng)來(lái)完成，MMPs是其降解的關(guān)鍵成分［7］，其中 MMP-2、MMP-9是膠原降解的關(guān)鍵酶［8］。MMP-9主要由上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是Ⅳ型糖化膠原酶的一種形式，主要底物有Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠，可以作用于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、彈性蛋白等ECM成分［9］。MMP-9出現(xiàn)于創(chuàng)面愈合早期，參與內(nèi)皮細(xì)胞核角質(zhì)形成細(xì)胞等的遷移、分化及新生血管形成［10］。MMP-2作用底物與MMP-9相同，但其作用范圍更廣泛，還可作用于Ⅶ型膠原、彈性蛋白、纖維粘連蛋白及蛋白聚糖的蛋白核心［11］。研究表明，MMP-2和MMP-9等多種MMPs在瘢痕成纖維細(xì)胞中表達(dá)明顯改變［12］，以上資料均提示 MMPs的表達(dá)與活性的降低，可能是增生性瘢痕形成的重要原因。

胸腺素β4是Low等［13］于1981年發(fā)現(xiàn)由43個(gè)氨基酸殘基形成的多肽，在機(jī)體廣泛分布，與機(jī)體免疫功能、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、創(chuàng)傷愈合以及肌動(dòng)蛋白功能均密切相關(guān)。胸腺素β4能加速血管再生、角質(zhì)形成層細(xì)胞遷移以及傷口收縮等一系列反應(yīng)，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合［14］。在Sosne等［15］的研究中，胸腺素β4能促進(jìn)角膜堿燒傷模型創(chuàng)面愈合。同時(shí)其發(fā)現(xiàn)，IL-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP-1）、MIP-2，單核趨化蛋白（MCP-2）等炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受到顯著的抑制，表明胸腺素β4能夠減少炎癥細(xì)胞的數(shù)量，下調(diào)炎癥趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，防止新生組織受到炎性反應(yīng)的損害。在心肌組織中，Bock-Marquette等［16］及 Hinkel等［17］的研究發(fā)現(xiàn)：胸腺素β4能抑制心肌瘢痕的形成，阻斷心肌細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)心肌修復(fù)及提高經(jīng)缺氧再氧合的心肌細(xì)胞存活率等。在治療增生性瘢痕方面，胸腺素β4改善基質(zhì)環(huán)境利于細(xì)胞的遷移和血管生成。Malinda等［18］的研究顯示，在正常小鼠皮膚創(chuàng)傷模型中，通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，胸腺素β4在特異性的趨化內(nèi)皮細(xì)胞遷移的同時(shí)，增加MMPs表達(dá)，加速基底膜降解，為血管生成創(chuàng)造條件。

本實(shí)驗(yàn)組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胸腺素β4能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并能劑量依賴性地降低增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的分泌及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的表達(dá)［19］。但關(guān)于腺素β4對(duì)成纖維細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9有何作用的報(bào)道較少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)體外培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)0.1、1.0、5.0μg／mL胸腺素β4能夠促進(jìn) MMP-2、MMP-9的表達(dá)，二者表達(dá)量上升，高于對(duì)照組。MMP-2、MMP-9是降解瘢痕組織中細(xì)胞外基質(zhì)的主要因素，加入胸腺素β4后 MMP-2、MMP-9的表達(dá)量增加，說(shuō)明胸腺素β4能夠促進(jìn)二者基因表達(dá)而發(fā)揮分解膠原的作用。胸腺素β4通過(guò)促進(jìn)MMPs表達(dá)減輕ECM沉積而減輕瘢痕增生和攣縮，有抑制瘢痕增生的作用。通過(guò)查閱文獻(xiàn)作者認(rèn)為，胸腺素β4能早期增強(qiáng)細(xì)胞間黏附因子（ICAM）表達(dá)，加速炎性反應(yīng)。保持較高的MMP-2水平以利于損傷早期加速清除壞死組織和基底膜的降解；晚期成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜的表達(dá)有利于上皮和表皮的增殖和血管重建［20］；而胸腺素β4對(duì)于 MMP-9的影響機(jī)制尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，仍待進(jìn)一步研究。

ECM在創(chuàng)傷修復(fù)中具有重要作用，基質(zhì)代謝平衡失調(diào)與增生性瘢痕的形成有密切關(guān)聯(lián)［21］，MMPs是起主要降解作用的膠原酶。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胸腺素β4能夠提高 MMP-2、MMP-9的表達(dá)減輕ECM沉積，為進(jìn)一步研究胸腺素β4應(yīng)用治療增生性瘢痕的機(jī)制提供了思路。MMP-2和MMP-9與其抑制因子在創(chuàng)面愈合轉(zhuǎn)歸中的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，胸腺素β4對(duì)其抑制因子的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

［1］ Abdou AG，Maraee AH，Al-Bara AM，et al.Immunohistochemical expression of TGF-β1in keloids and hypertrophic scars［J］.Am J Dermatopathol，2011，33（1）：84-91.

［2］ Alster TS，Tanzi EL.Hypertrophic scars and keloids［J］.Am J Clin Dermatol，2003，4（4）：235-243.

［3］ Naitoh M，Hosokawa N，Kubota H，et al.Upregulation of HSP47and collagen typeⅢin the dermal fibrotic disease，keloid［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，280（5）：1316-1322.

［4］ Philp D，Scheremeta B，Sibliss K，et al.Thymosin beta4 promotes matrix metalloproteinase expression during wound repair［J］.J Cell Physiol，2006，208（1）：195-200.

［5］ 劉愛(ài)東，王玥，龐久玲，等.基質(zhì)金屬蛋白酶7和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在病理性瘢痕中的表達(dá)：與正常瘢痕及正常皮膚組織比較［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16（7）：1165-1168.

［6］Imaizumi R，Akasaka Y，Inomata N，et al.Promoted activation of matrix metalloproteinase（MMP）-2in keloid fibroblasts and increased expression of MMP-2in collagen bundle regions：implications for mechanisms of keloid progression［J］.Histopathology，2009，54（6）：722-730.

［7］ Tanriverdi-Akhisaroglu S，Menderes A，Oktay G.Matrix metalloproteinase-2and-9activities in human keloids，hypertrophic and atrophic scars：apilot study［J］.Cell Biochem Funct，2009，27（2）：81-87.

［8］ 張文，趙潔，畢朝暉.心肌損傷標(biāo)志物在小兒病毒性心肌炎診斷中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，8（11）：119-121.

［9］ 陳小婷，歐斌賢，唐屈，等.苦參堿對(duì)體外培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞 MMP-1、MMP-9表達(dá)的影響［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2014，43（5）：624-626.

［10］李文娟，陳偉，付小兵，等.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子在增生性瘢痕中的表達(dá)特征及意義［J］.感染、炎癥、修復(fù)，2005，6（4）：207-209.

［11］李開(kāi)通，劉達(dá)恩，陳小婷，等.水蛭素對(duì)增生性瘢痕基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9表達(dá)作用的影響［J］.山東醫(yī)藥，2012，52（20）：28-29，88.

［12］Parks WC.Matrix metalloproteinases in lung repair［J］.Eur Respir J Suppl，2003，44：36s-38s.

［13］Low TL，Hu SK，Goldstein AL.Complete amino acid sequence of bovine thymosin beta 4：a thymic hormone that induces terminal deoxynucleotidyl transferase activity in thymocyte populations［J］.Mol Cell Biochem，1981，78（2）：1162-1166.

［14］于虎，張朔瑒，馬瑞玨，等.胸腺素β4促進(jìn)創(chuàng)傷愈合機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2010，33（4）：235-238.

［15］Sosne G，Xu L，Prach L，et al.Thymosin beta 4stimulates laminin-5production independent of TGF-beta［J］.Exp Cell Res，2004，293（1）：175-183.

［16］Bock-Marquette I，Saxena A，White MD，et al.Thymosin β4activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration，survival and cardiac repair［J］.Nature，2004，432（7016）：466-472.

［17］Hinkel R，El-Aouni C，Olson T，et al.Thymosin beta4is an essential paracrine factor of embryonic endothelial progenitor cell-mediated cardioprotection［J］.Circulation，2008，117（17）：2232-2240.

［18］Malinda KM，Goldstein AL，Kleinman HK.Thymosin beta（4）stimulates directional migration of human umbilical vein endothelial cells［J］.FASEB J，1997，11（6）：474-481.

［19］朱璇.胸腺素β4對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞膠原合成和CTGF表達(dá)的影響［D］.南昌：南昌大學(xué)，2013.

［20］李艷，王冠，于虎，等.重組胸腺素β4調(diào)節(jié)ICAM-1、MMP-2和LN-5促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的實(shí)驗(yàn)研究［J］.組織工程與重建外科雜志，2008，4（3）：142-145，163.

［21］Gailit J，Clark RA.Wound repair in the context of extracellular matrix［J］.Curr Opin Cell Biol，1994，6（5）：717-725.