曹曉靜，宋曉翠，杜麗艷，楊德志，馬 超，宋曉昕，楊文霞

(河北省邢臺市第一醫(yī)院，河北 邢臺 054001)

Livin、Survivin、Fas、FasL在胃癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

曹曉靜，宋曉翠，杜麗艷，楊德志，馬 超，宋曉昕，楊文霞

(河北省邢臺市第一醫(yī)院，河北 邢臺 054001)

目的探討Livin、Survivin、Fas、FasL在胃癌組織中的表達(dá)情況及與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法檢測11例正常胃黏膜組織和102例胃癌組織中Livin、Survivin、Fas、FasL的表達(dá)情況，分析各指標(biāo)表達(dá)情況與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織中Livin、Survivin和FasL的陽性表達(dá)率顯著高于正常胃黏膜組織(P均<0.05)，F(xiàn)as的陽性表達(dá)率顯著低于正常胃黏膜組織(P<0.05)。Livin的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P均<0.05)，Survivin的表達(dá)和腫瘤分化程度明顯相關(guān) (P<0.05)，而Fas和FasL的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。胃癌組織中Livin和Survivin的表達(dá)與Fas、FasL表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論Livin、Survivin在胃癌組織中高表達(dá)，參與抑制細(xì)胞凋亡，與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為胃癌的治療提供了新的途徑和方向。

胃癌；免疫組化；Livin；Survivin；Fas；FasL

胃癌在全世界很多國家的發(fā)病率都很高，極大危害了人類的健康。在中國每年都有很多的新發(fā)胃癌患者，因此胃癌的研究是我國醫(yī)務(wù)人員需要面對的重要問題。導(dǎo)致胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素有很多，胃癌細(xì)胞凋亡機(jī)制受到抑制是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要促進(jìn)因素。目前研究認(rèn)為，凋亡抑制蛋白家族(IAPs)、Caspase家族、死亡受體(Fas)和配體(FasL)、BCL-2J家族等均可參與凋亡的調(diào)節(jié)，IAP家族有8個(gè)成員，其中抗凋亡作用較強(qiáng)的有Survivin和Livin[1]。近年來，消化系統(tǒng)腫瘤中Livin和Survivin的研究已經(jīng)取得了明顯進(jìn)展[2]，但在胃癌中和Fas、FasL關(guān)系的研究不多。本研究檢測了Livin、Survivin、Fas、FasL在胃癌組織中的表達(dá)情況，并分析各指標(biāo)與臨床病理特征的關(guān)系，旨在為胃癌的綜合治療提供新的途徑和方向。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2010年6月—2012年6月經(jīng)手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本102例作為胃癌組，男64例，女38例；年齡25～81歲，中位年齡58歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移76例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；腫瘤組織標(biāo)本直徑<5 cm 46例，≥5 cm 56例；腫瘤浸潤深度為T1、T2共37例， T3、T4共65例；高分化、中分化共31例，低分化、未分化共71例；UICC分期：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期67例。另選取11例癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本作為正常組?；颊呔型暾呐R床資料，術(shù)前未接受放化療，標(biāo)本均經(jīng)HE染色病理證實(shí)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 Livin兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，Survivin兔抗人多克隆抗體購自Zemet公司，F(xiàn)as兔多克隆抗體和FasL兔多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的工作試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 術(shù)后立即取材，以10%福爾馬林液固定2～3 d。然后脫水固定，標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋。蠟塊4 μm連續(xù)切片，貼于預(yù)先涂有APES的載玻片上，56 ℃烘烤24 h備用。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、自來水沖洗，以3%過氧化氫溶液室溫(15～20 ℃) 孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗組織切片置于枸櫞酸鹽緩沖液(0.1 mmol/L，pH 6.0)中，用微波爐加熱并保持92～98 ℃ 15 min，行抗原修復(fù)。滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，工作濃度Livin為1∶50，Survivin為1∶50，F(xiàn)as為1∶400,FasL為1∶400。以PBS溶液代替一抗做空白對照。滴加生物素標(biāo)記的二抗、滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素。DAB顯色，顯微鏡下觀察統(tǒng)一控制顯色時(shí)間，終止顯色封片。采用Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。

1.4結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生雙盲閱片。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中免疫組化顯色深度和陽性細(xì)胞數(shù)量所占百分比進(jìn)行半定量積分評估，每例標(biāo)本每個(gè)觀測指標(biāo)在顯微鏡下隨機(jī)抽取5個(gè)高倍視野(×400)。顯色度記分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)量所占百分比記分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)指標(biāo)分?jǐn)?shù)相乘為最后得分，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(),9～12分為強(qiáng)陽性()。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Livin、Survivin、Fas、FasL鏡下表達(dá)情況 Livin蛋白主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,顯示為棕黃色顆粒，見圖1；Livin蛋白在正常胃黏膜組織表達(dá)為陰性，見圖2；Survivin蛋白主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),表現(xiàn)為棕黃色顆粒，見圖3；Survivin蛋白在正常胃黏膜組織表達(dá)為陰性，見圖4；Fas、FasL蛋白陽性著色定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),表現(xiàn)為棕黃色顆粒，而在正常胃黏膜組織無明顯表達(dá)，見圖5～8。

2.2Livin、Survivin、Fas、FasL陽性表達(dá)情況 胃癌組Livin、Survivin、FasL陽性表達(dá)率均明顯高于正常組(P均<0.05)，F(xiàn)as陽性表達(dá)率明顯低于正常組(P<0.05)。見表1。

2.3胃癌組Livin、Survivin、Fas、FasL表達(dá)情況與臨床病理因素的關(guān)系 Livin的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P均<0.05)，但與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度及TNM分期無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。Survivin的表達(dá)和腫瘤分化程度明顯相關(guān)(P<0.05)，但與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度及TNM分期無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。Fas和FasL的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。見表2。

圖1 Livin在胃癌組織的表達(dá)情況(SP×400)

圖2 Livin在正常胃黏膜組織的表達(dá)情況(SP×400)

圖3 Survivin在胃癌組織的表達(dá)情況(SP×400)

圖4 Survivin在正常胃黏膜組織的表達(dá)情況(SP×400)

圖5 Fas在胃癌組織的表達(dá)情況(SP×400)

圖6 Fas在正常胃黏膜組織的表達(dá)情況(SP×400)

圖7 FasL在胃癌組織的表達(dá)情況(SP×400)

圖8 FasL在正常胃黏膜組織的表達(dá)情況(SP×400)

表 1 Livin、Survivin、Fas、FasL陽性表達(dá)情況 例(%)

注：①與正常組比較，P<0.05。

2.4胃癌組Livin、Survivin與Fas、FasL表達(dá)的相關(guān)性 胃癌組織中Livin、Survivin表達(dá)與Fas、FasL 表達(dá)無明顯相關(guān)關(guān)系(P均>0.05) 。見表3。

3 討 論

細(xì)胞凋亡異常在許多人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。如果細(xì)胞凋亡受到抑制，細(xì)胞增殖與凋亡的平衡被破壞，將導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目不斷增加，表現(xiàn)出生長趨勢，這是腫瘤形成的一個(gè)重要基礎(chǔ)。目前對凋亡抑制蛋白家族的結(jié)構(gòu)研究比較清楚，其共同特點(diǎn)為N端含有桿狀病毒IAP重復(fù)序列(baculovirus IAP repeat,BIR)，C端含有或不含有一個(gè)環(huán)指(ring finger)結(jié)構(gòu)，其中BIR結(jié)構(gòu)為抑制細(xì)胞凋亡的主要結(jié)構(gòu)。該家族中Livin的抗凋亡途徑主要有3個(gè)調(diào)控途徑：①Caspase信號途徑，Livin間接或直接與Caspase-3, 7, 9結(jié)合，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡功能[3]；②激活TAK1/JNK1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減少細(xì)胞凋亡[4]；③Livin和Smac/DLABLO還可以相互制約，調(diào)控細(xì)胞凋亡[5]。在許多惡性腫瘤如消化道腫瘤(胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、食管癌)、泌尿系腫瘤(腎癌、膀胱癌、前列腺癌)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、血液系統(tǒng)腫瘤等中Livin均呈高表達(dá)狀態(tài)[6-11]，其高表達(dá)可能干擾了細(xì)胞分化、增殖與凋亡的平衡，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，使惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)量異常增多，從而發(fā)生、發(fā)展為惡性腫瘤。而Survivin作用途徑為：①直接或間接和Caspase-3,7結(jié)合，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用；②參與細(xì)胞增殖、分裂過程和細(xì)胞周期的調(diào)控；③參與腫瘤中血管形成從而抑制細(xì)胞凋亡。而Fas/FasL途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡目前比較清楚，即細(xì)胞膜上的Fas受體和FasL的結(jié)合能啟動細(xì)胞凋亡。

表2 胃癌組織中Livin、Survivin、Fas、FasL表達(dá)情況與臨床病理因素的關(guān)系 例

表3 Livin、Survivin和 Fas、 FasL表達(dá)相關(guān)性 例

本研究結(jié)果顯示，在胃癌組織中Livin、Survivin明顯高表達(dá)，而在正常胃組織中幾乎不表達(dá)，與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道基本一致；胃癌組織中Livin的表達(dá)與腫瘤組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，而與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度及TNM分期無明顯相關(guān)性，提示Livin表達(dá)程度越高其腫瘤惡性度越高，表現(xiàn)為組織分化程度低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性大；Survivin的表達(dá)與腫瘤組織分化程度明顯相關(guān)，但與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)及TNM分期無明顯相關(guān)性，提示Survivin的高表達(dá)可能抑制了腫瘤細(xì)胞凋亡，破壞了腫瘤細(xì)胞分化、增殖與凋亡之間的平衡，導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展。在胃癌組織中FasL明顯高表達(dá)，F(xiàn)as明顯低表達(dá)，提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展中存在著Fas、FasL的表達(dá)失衡,Fas/FasL系統(tǒng)的平衡失調(diào)可能是胃黏膜癌變過程中細(xì)胞凋亡抑制的重要機(jī)制之一，推測Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與胃癌的形成密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析了Livin和Survivin表達(dá)與Fas、FasL的相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)Livin、Survivin與Fas、FasL之間存在明顯相關(guān)性，說明在胃癌組織中，Livin、Survivin抑制細(xì)胞凋亡作用和Fas/FasL途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡沒有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，Livin、Survivin在胃癌組織中高表達(dá)，參與抑制細(xì)胞凋亡，與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，為胃癌的治療提供了新的途徑和方向。但該如何具體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，能否通過抑制 Livin、Survivin的表達(dá)而恢復(fù)腫瘤細(xì)胞正常凋亡過程，從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展還有待繼續(xù)研究。

[1] Salvesen GS,Duckett CS. IAP proteins: Blocking the road to death’s door[J]. Nat Rav Mol Cell Biol,2002，3(6):401-410

[2] Dubrez DL,Dupoux A,Cartier J. IAPs: more than just inhibitors of apoptosis proteins[J]. Cell Cycle,2008,7(8):1036-1046

[3] Huerta S,Heinzerling JH,Anguiano-Hernandez YM,et al. Modification of gene products involved in resistance to apoptosis in metastatic colon cancer cells:roles of Fas,Apaf-1, NFkappaB, IAPs, Smac /DIABLO,and AIF[J]. J Surg Res,2007,142(1):184-194

[4] Chen YS,Li HR,Lin M,et al. Livin abrogates apoptosis of SPC-A1 cell by regulating JNKI signaling pathway[J]. Mol Biol Rep,2010,37(5):2241-2247

[5] Maas C,Verbrugge I,de Vries E,et al. Smac /DIABLO release from mitochondria and XIAP inhibition are essential to limit clonogenicity of Type I tumor cells after TRAIL receptor stimulation[J]. Cell Death Differ,2010,17(10):1613-1623

[6] 余曉萍,張艷,朱翠明，等. Livin的siRNA對胃癌細(xì)胞BGC823生長與功能影響的初步研究[J]. 中華腫瘤防治雜志,2010,17(21):1722-1726

[7] 王永，宋怡才，尹作文，等. Livin mRNA在結(jié)直腸癌、腺瘤和正常黏膜中的表達(dá)差異及意義[J/CD]. 中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)：電子版,2011,5(3):195-197

[8] 周通,景鴻恩. 原發(fā)性肝癌中Livin和Bcl-2的相關(guān)性研究[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究,2010,8(13):22-24

[9] 段永順,徐峰,宋偉強(qiáng),等. 凋亡抑制蛋白Livin在腎癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 解剖進(jìn)展學(xué),2012,18(1)：4-7

[10] 高偉興,張新,張立國,等. 膀胱尿路上皮癌組織中Livin蛋白的表達(dá)和預(yù)后的關(guān)系[J]. 西部醫(yī)學(xué),2011,23(2):236-238

[11] Yang YL,Lin SR,Chen JS,et al. Expression and prognostic significance of the apoptotic genes BCL2L13, Livin and CASP8AP2 in childhood acute lymphoblastic leukemia[J]. Leuk Res,2010,34(1):18-23

[12] 陳曉燕，韓子華. 胃癌組織中Livin蛋白的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系[J]. 中國藥物與臨床，2010，10(11)：1230-1232

[13] 檀碧波，李勇，范立僑,等. 胃癌凋亡相關(guān)蛋白Survivin、B淋巴細(xì)胞/白血病-2、bax表達(dá)與腫瘤細(xì)胞體外化療敏感性的關(guān)系[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29(7)：1315-1317

Study on the relationgship and the expression of Livin, Survivin and Fas/FasL in gastric carcinoma

CAO Xiaojing, SONG Xiaocui, DU Liyan, YANG Dezhi, MA Chao, SONG Xiaoxin, YANG Wenxia

(The First Hospital of Xingtai, Xingtai 054001, Hebei, China)

Objective It is to investigate the expression of Livin, Survivin, Fas and FasL in gastric carcinoma and the correlation with the clinical pathological features. Methods The expressions of Livin, Survivin, Fas and FasL were detected by immunohistochemical SP method in 102 cases of gastric carcinomas and 11 cases of human normal gastric tissues, then the expression of them and the correlation with clinical pathological features were analyzed. Results The expressions of Livin, Survivin and FasL in gastric carcinoma were significantly higher than that in normal gastric tissues (allP<0.05). The expression of Fas in gastric carcinoma was significantly lower than that in normal gastric tissues (P<0.05). Livin positive expression was significantly associated with degrees of differentiation and lymphatic metastasis (allP<0.05). Surviving expression was significantly correlated with the degree of tumor differentiation (P<0.05). And the expression of Fas and FasL had no significant correlation with age, gender, tumor size, location, depth of invasion, lymph node metastasis, distant metastasis and TNM staging (allP>0.05). There was no significant correlation between Livin, Survivin and Fas, Fasl in human gastric carcinoma (P>0.05). Conclusion Livin, Survivin are high expression in gastric carcinoma, they participate in the inhibition of cell apoptosis and closely relate with gastric carcinoma development and progression. This will provide a new strategy and direction for gastric carcinoma targeted therapy.

gastric carcinoma; immunhistochemistry; Livin; Survivin; Fas; FasL

曹曉靜，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃腸腫瘤外科工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.36.006

R735.2

A

1008-8849(2015)36-4006-04

2015-06-01