林壽寧，陳思羽，程 臣，朱永蘋

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

壯肝逐瘀煎對肝纖維化大鼠血清Fas/FasL表達(dá)的影響

林壽寧1，陳思羽1，程 臣2，朱永蘋1

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

目的觀察壯肝逐瘀煎對肝纖維化大鼠血清Fas/FasL表達(dá)的影響，探討該組方抗肝纖維化的作用機(jī)制。方法將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和治療組，除空白組外其余大鼠均采用CCl4復(fù)合因素法制作肝纖維化大鼠模型，模型制作成功后，治療組給予壯肝逐瘀煎灌胃，空白組及模型組僅予等容量生理鹽水灌胃。10周末所有大鼠經(jīng)股靜脈采血后處死并獲取肝組織，HE染色光鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化，ELISA法測定血清Fas、FasL水平。結(jié)果光鏡觀察空白組肝小葉完整、結(jié)構(gòu)正常，造模組肝纖維化程度明顯，治療組肝纖維化程度較輕；ELISA測定顯示治療組大鼠血清Fas和FasL水平顯著低于模型組(P均<0.05)。結(jié)論壯肝逐瘀煎可有效治療大鼠肝纖維化，其作用可能是通過下調(diào)Fas、FasL的表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。

壯肝逐瘀煎；肝纖維化；Fas；FasL；大鼠

近年研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活導(dǎo)致了細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積，是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。此前實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，壯肝逐瘀煎可以抑制肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞的活化及增殖[2]。為了進(jìn)一步研究壯肝逐瘀煎抗肝纖維化的作用機(jī)制，筆者觀察了該方對肝纖維化大鼠血清Fas、FasL表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1動物與藥物 清潔級SD大鼠38只，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，由廣西食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號:SCXK(桂)-2014-0001]。壯肝逐瘀煎免煎顆粒(黃芪20 g、靈芝20 g、當(dāng)歸10 g、絞股藍(lán)20 g、炒鱉甲20 g、地鱉蟲10 g、虎杖15 g、田七5 g)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科提供；秋水仙堿購自西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號：H53021369)；四氯化碳(CCl4)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；Fas、FasL酶聯(lián)免疫試劑盒購自武漢博士德生物公司。

1.2分組與造模 隨機(jī)取14只大鼠作為空白組，正常飼養(yǎng)。剩余大鼠采用改進(jìn)的CCl4復(fù)合因素法[3]制作大鼠肝纖維化模型，即采用高脂低蛋白食物(以玉米面為飼料，加0.5%膽固醇)飼養(yǎng)，10%乙醇為唯一飲料[11]， 第1次皮下注射CCl45 mL/kg，以后每隔3 d皮下注射CCl4油劑(40%棉籽油溶液)[12]3 mL/kg。于第4周末隨機(jī)處死空白組及造模大鼠各4只，病理檢測證實(shí)造模大鼠肝纖維化形成。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組和治療組，每組10只。然后治療組予壯肝逐瘀煎灌胃1次/d，實(shí)驗(yàn)劑量相當(dāng)于成人日用量的40倍，模型組、空白組僅給予等容量生理鹽水灌胃。為了防止肝臟自然修復(fù)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，除空白組外，其他2組于造模結(jié)束后仍每周注射40%CCl4油劑3 mL/kg 1次。

1.3取材與檢測 于用藥治療6 周末，所有大鼠在完成最后一次灌胃后禁食12 h，使用1%戊巴比妥鈉皮下麻醉，經(jīng)股靜脈采血，2 000 r/min離心15 min，收集血清，-70 ℃儲存待測。血清Fas、FasL水平采用ELISA測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。采血后將大鼠處死，立即剖取肝臟，在每片肝右葉的大致相同部位取一小塊肝組織，用10%福爾馬林液固定，做常規(guī)石蠟切片。肝組織HE 染色后光鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝臟組織的病理學(xué)表現(xiàn) 光鏡下，空白組肝小葉完整、結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞以靜脈為中心呈條索狀向四周放射狀排列，見圖1。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，較多粗大膠原纖維分割、包繞肝小葉，肝細(xì)胞水腫明顯，脂肪變性廣泛，部分有壞死，纖維隔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，見圖2。治療組與模型組比較肝小葉結(jié)構(gòu)較清楚，膠原纖維增生較少，纖維疏松變窄，肝細(xì)胞水腫及變性不明顯，炎細(xì)胞浸潤較少，見圖3。

圖1 空白組肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×100)

2.2各組大鼠血清Fas、FasL水平比較 模型組血清Fas、FasL水平明顯高于空白組(P均<0.05)， 治療組血清Fas、FasL水平較模型組明顯降低(P均<0.05)。見表1。

3 討 論

圖2 模型組肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×100)

圖3 治療組肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×100)

表1 各組大鼠血清Fas、FasL水平比較

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

肝纖維化是多種慢性肝病病情發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)，是各種致病因素導(dǎo)致肝內(nèi)彌散性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的病理過程，其實(shí)質(zhì)是肝細(xì)胞外間質(zhì)的結(jié)締組織增生。肝臟細(xì)胞外基質(zhì)特別是膠原物質(zhì)過度活化，主要以活化的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞為主。隨著病理反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，由激活的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化的肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞日益增多，致使細(xì)胞外基質(zhì)生成逐漸遠(yuǎn)超其降解負(fù)荷，過多細(xì)胞外基質(zhì)因無力降解而在肝臟內(nèi)沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化形成。在這一過程中，部分肝細(xì)胞在損傷因素的作用下死亡而發(fā)生變性而釋放凋亡小體，肝星狀細(xì)胞及庫否細(xì)胞吞噬凋亡小體后可刺激肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，導(dǎo)致膠原生成增加，肝纖維化形成[1]。雖然肝纖維化的形成是多種細(xì)胞共同作用下的結(jié)果，但激活的肝星狀細(xì)胞是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的來源[4]，是肝纖維化產(chǎn)生與發(fā)展的重要因素。

Fas又稱Apo-1或CD95分子，與腫瘤壞死因子(TNF)受體和神經(jīng)生長因子(NGF)受體等皆屬于TNF和NGF受體超家族，是一種富含319個氨基酸的死亡受體。FasL又名CD178分子，屬于TNF配體超家族，是一種具有三聚體結(jié)構(gòu)的Fas天然配體，可特異性地與Fas相結(jié)合。Fas、FasL因子參與了調(diào)控細(xì)胞凋亡，這一嚴(yán)密而完整的機(jī)制包含了一系列的環(huán)節(jié)及各自相關(guān)的信號傳導(dǎo)作用[5]。Fas /FasL 結(jié)合后，需要Fas 蛋白的胞內(nèi)區(qū)通過其C末端死亡區(qū)(DD)與Fas相關(guān)的死亡域蛋白(FADD) 結(jié)合，而FADD 羥基末端與Fas蛋白的胞內(nèi)區(qū)結(jié)合后，其氨基末端則是引起死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需成分，稱為死亡效應(yīng)(DED)。FADD通過DED 區(qū)直接與Caspase-8 結(jié)合使后者活化，進(jìn)一步啟動Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6]。另一方面，F(xiàn)as/FasL還可使鞘磷酸酯酶活化，使鞘磷酸分解生成神經(jīng)酰胺，然后通過絲/蘇氨酸蛋白磷酸激酶的作用誘導(dǎo)IP3、DAG等第二信使的活化，使胞內(nèi)Ca2+/Mg2+值升高，從而激活相關(guān)核酸酶，導(dǎo)致DNA斷裂和固縮，刺激谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶使胞漿內(nèi)蛋白分子交聯(lián)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[7]。Gong等[8]研究發(fā)現(xiàn)，只有存在于活化肝星狀細(xì)胞表面的Fas才對FasL敏感，凋亡機(jī)制才能啟動?？梢姡接慒as/FasL誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡是研究抗肝纖維化藥物作用機(jī)制的重要內(nèi)容。

壯肝逐瘀煎是基于肝纖維化正虛瘀結(jié)的基本病機(jī)而設(shè)。壯肝之意在于養(yǎng)護(hù)肝之陰血為主，兼顧健脾益腎之法。逐瘀之意在于驅(qū)除瘀毒之邪，法以活血化瘀、清熱解毒為主。方中當(dāng)歸、靈芝以養(yǎng)肝陰益肝血，黃芪以補(bǔ)脾氣、扶正氣，鱉甲、地鱉蟲以活血逐瘀、消除癥瘕，絞股藍(lán)兼以扶正氣、解邪毒，田七活血止血，虎杖解毒化濕、活血破結(jié)[9]。綜觀全方，可活血化瘀，清熱解毒，同時養(yǎng)肝護(hù)陰，健脾益腎，用于肝纖維化切合病機(jī)，故本研究治療組取得了較好療效。

綜上，壯肝逐瘀煎不僅有較好的抗肝纖維化作用，而且能顯著降低肝纖維化大鼠血清Fas、FasL水平。通過調(diào)控Fas/FasL的表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞的凋亡可能是壯肝逐瘀煎抗肝纖維化的重要機(jī)制。

[1] Guicciardi ME,Gores GJ.Apoptosis:a mechanism of acute and chronic liver injury[J]. Gut,2005,54(7):1024-1033

[2] 黃貴華,林壽寧,王振常. 壯肝逐瘀煎對大鼠肝星狀細(xì)胞活化的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2004,27(5):36-38

[3] 韓德五,馬學(xué)惠,趙元昌. 肝硬化動物模型的研究[J]. 山西醫(yī)藥雜志，1979(4):1-3

[4] Wang LH,Batey TG,George J. Role of ethanol in the regulation of hepatic stellate cell function[J]. World J Gastroenterol,2006,12(43):6926-6932

[5] Sail B,Matthes N,Knittel T,et al. Transform in growth factor β and tumor necrosis factor α inhibit both apoptosis and proliferation of activated rat hepatic stellate cells[J]. Hepatology,1999,30(1):196-202

[6] Fuentes-Prior P,Salvesen GS. The protein structuresthat shape caspase activity,specificity,activation and inhibition[J]. Biochem J,2004,384(Pt2):201

[7] Iwase M,Kondo G,Watanabe H,et al. Regulation of fas-mediated apoptosis in neutrophils after surgery induced acute inflammation[J]. J Surg Res,2006,134(1):114-123

[8] Gong WR,Pecci A,Roth S,et al. Transformation-dependent susceptibility of rat hepatic stellate cells to apoptosis induced by soluble fas ligand[J]. Hepatology,1998,28(2):492-502

[9] 林壽寧. 林沛湘學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)集[M]. 北京:科學(xué)出版社,2012：4-22

Effect of Zhuanggan Zhuyu Decoction on serum Fas/FasL expression in rats with liver fibrosis

LIN Shouning1, CHEN Siyu1, CHENG Chen2, ZHU Yongping1

Objective It is to observe the influence of Zhuanggan Zhuyu Decoction on serum Fas/FasL expression in rats with liver fibrosis, and explore the action mechanism of anti-liver fibrosis. Methods The SD rats were divided into blank group, model group and treatment group, the rats model of liver fibrosis except blank group were established with CCl4 composite factor method. After the models were successfully, the rats were treated with Zhuanggan Zhuyu Decoction by gavage in treatment group, and with same amount of normal saline in the blank group and model group. At the end of the 10th week the blood were collected through the femoral vein in all rats, then the animals were sacrificed to obtain liver tissue, the structural changes in liver tissue were observed by HE staining and light microscope, and the Fas, FasL expression of the blood were detected by ELISA. Results Light microscopy showed that blank group with normal hepatic lobe and complete structure, modle group with significantly liver fibrosis, and treatment group with mild liver fibrosis; ELISA determination results showed that the serum Fas, FasL expression in treatment gorup were singificantly lower than that in model group (allP<0.01). Conclusion Zhuanggan Zhuyu Decoction is effective in the treatment of liver fibrosis in rats, and its mechanism may be through reduce the expression of Fas, FasL, and inhibit hepatic stellate cells apoptosis.

Zhuanggan Zhuyu Decoction; liver fibrosis; Fas; FasL; rat

林壽寧，男，主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)疾病中醫(yī)研究工作。

陳思羽，E-mail:yuyushun1124@yahoo.com.cn

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260533)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.36.002

R-332

A

1008-8849(2015)36-3994-03

2015-03-17

(1. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi, Chian; 2. The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530023, Guangxi, China)