戴瓊艷(綜述)，段滿林(審校)

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院麻醉科，南京210002)

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電壓依賴性陰離子通道的研究進(jìn)展

戴瓊艷△(綜述)，段滿林※(審校)

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院麻醉科，南京210002)

摘要：電壓依賴性陰離子通道(VDAC)位于線粒體外膜，形成了線粒體和代謝產(chǎn)物之間的分界，作為“守門員”控制著代謝產(chǎn)物的進(jìn)出以及線粒體與其他細(xì)胞器的對話，同時(shí)，VDAC也是線粒體介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵成員。除了調(diào)節(jié)線粒體的代謝和產(chǎn)能功能，VDAC通過與不同配體和蛋白相互作用，作為細(xì)胞生存和死亡信號(hào)的匯聚點(diǎn)，這些功能可能使VDAC成為合理的新治療發(fā)展的靶點(diǎn)?，F(xiàn)就哺乳動(dòng)物VDAC蛋白(尤其是VDAC1)的結(jié)構(gòu)、功能、與相關(guān)蛋白的關(guān)系以及VDAC參與的疾病作一綜述。

關(guān)鍵詞：電壓依賴性陰離子通道；線粒體；凋亡

隨著對線粒體功能研究的深入，發(fā)現(xiàn)其除了生物供能以外，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)細(xì)胞器之間的聯(lián)系、老化，細(xì)胞增殖、疾病和凋亡調(diào)節(jié)中也有重要作用。Schein等于1976年首次在人工構(gòu)建的線粒體脂質(zhì)雙分子膜中發(fā)現(xiàn)并純化了具有電壓依賴性和陰離子選擇性的嵌入蛋白，并將其命名為電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)，它是相對分子質(zhì)量為31 000的孔道蛋白，存在于所有真核生物線粒體外膜上[1]。研究表明，VDAC不僅參與能量代謝，還是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵成員[2],特別是在線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔中的作用[3]，雖然線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合體至今仍未成功分離，但有證據(jù)表明VDAC很可能是其組分之一。VDAC通過與Ca2+、ATP、谷氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸以及不同蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性，在維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞生存方面發(fā)揮重要功能?，F(xiàn)就VDAC的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1VDAC的生物學(xué)特征

1.1VDAC亞型VDAC有3種亞型，被3種不同的基因編碼：VDAC1、VDAC2和VDAC3，這3種蛋白共享著高度類似的序列，有65%～70%的同一性。所有VDAC亞型在大部分組織中均能找到，只是數(shù)量不同，其中VDAC1是最豐富的亞型，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示在HeLa 細(xì)胞中，mRNA水平上VDAC1是VDAC2的10倍，比VDAC3多100倍[4]。

3種亞型各有不同的生理功能。如敲除小鼠的VDAC1導(dǎo)致心肌和骨骼肌中呼吸鏈復(fù)合物活性產(chǎn)生缺陷，而敲除VDAC3，這種缺陷只出現(xiàn)于心臟[5]；VDAC1和VDAC2基因敲除的小鼠，呼吸容量減少[6]；而敲除VDAC3可導(dǎo)致雄性不育，VDAC1和VDAC3均敲除會(huì)引起生長抑制[7]。

蛋白組學(xué)調(diào)查和其他研究表明，所有VDAC亞型均是翻譯后修飾。VDAC1的氨基酸序列分析顯示第1個(gè)蛋氨酸被刪除了，而第2個(gè)氨基酸即丙氨酸被乙酰化[8]。其他報(bào)道的翻譯后修飾為VDAC的絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸殘基發(fā)生了磷酸化，賴氨酸乙?；痆9]，但這些修飾對VDAC蛋白活性的影響仍不清楚。

1.2VDAC結(jié)構(gòu)1985年，Mihara和Sato[10]首次確定了VDAC的一級結(jié)構(gòu)。通過VDAC結(jié)構(gòu)中的親水性和疏水性殘基以及細(xì)菌膜孔蛋白的晶體學(xué)研究，推測VDAC會(huì)形成一個(gè)β桶狀結(jié)構(gòu)。2008年三個(gè)研究小組[11-13]分別用不同的方法確定了VDAC1的三維結(jié)構(gòu)，是由19個(gè)β折疊鏈形成的一個(gè)β桶狀結(jié)構(gòu)，每條β折疊鏈平均由10個(gè)氨基酸殘基組成，其N末端結(jié)構(gòu)域有25個(gè)氨基酸長度的殘基，以α螺旋形式分布于VDAC孔內(nèi)，該α螺旋片段對VDAC的門控作用很關(guān)鍵，可能是作為電壓感受器，也可能調(diào)節(jié)通道對離子和代謝產(chǎn)物的傳導(dǎo)。此外，VDAC1-N末端參與凋亡的誘導(dǎo)，它可作為結(jié)合位點(diǎn)與己糖激酶(hexokinase,HK)Ⅰ和Bcl-2家族蛋白相互作用。

1.3VDAC通道活性在低電壓(10 mV)時(shí)，VDAC通道穩(wěn)定的處于開放狀態(tài)(持續(xù)2 h)，表現(xiàn)為陰離子選擇性和對多價(jià)陰離子代謝產(chǎn)物通透，包括磷酸肌酸、磷酸鹽、琥珀酸鹽和ATP[14]；在高電壓(>40 mV)時(shí)，VDAC由開放轉(zhuǎn)為關(guān)閉，表現(xiàn)為對陽離子通透的低傳導(dǎo)狀態(tài)[15]。

另外，不同的物質(zhì)，如Ca2+、ATP、谷氨酸鹽、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸等被認(rèn)為與VDAC相互作用，調(diào)節(jié)VDAC的通道活性[16]。

1.4VDAC過表達(dá)與細(xì)胞生存VDAC1參與多種刺激誘導(dǎo)的凋亡。用小分子干擾RNA技術(shù)沉默VDAC1 表達(dá)可有效阻止順氯氨鉑誘導(dǎo)的凋亡和促凋亡蛋白Bax的激活，也可減少內(nèi)皮抑素誘導(dǎo)的凋亡[17]和抑制亞硒酸鹽誘導(dǎo)的線粒體通透性轉(zhuǎn)換[18]。

VDAC1過表達(dá)可使線粒體內(nèi)膜去極化并觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；U-937細(xì)胞過表達(dá)鼠(m)VDAC或兔(r)VDAC導(dǎo)致細(xì)胞死亡70%～85%[19]。Godbole等[20]也報(bào)道，過表達(dá)水稻VDAC誘導(dǎo)了凋亡(約70%)；而將牙鲆VDAC轉(zhuǎn)染到魚細(xì)胞中也得到了相似的結(jié)果。

此外，化療或放療后，腫瘤生長得到有效抑制，而腫瘤細(xì)胞上的VDAC表達(dá)也增加。如凋亡敏感細(xì)胞經(jīng)紫外線或者暴露于抗癌藥熊果酚苷或順氯氨鉑后，VDAC表達(dá)上調(diào)。

2VDAC與線粒體依賴性凋亡相關(guān)因子的相互作用

VDAC位于線粒體外膜，是線粒體與外界發(fā)生關(guān)系的第一道門，線粒體依賴性凋亡相關(guān)因子首先和它接觸，進(jìn)而啟動(dòng)后續(xù)的凋亡程序，因此它是凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白。

2.1HK離體和在體的研究表明，HK-Ⅰ和HK-Ⅱ可保護(hù)細(xì)胞避免發(fā)生線粒體介導(dǎo)的凋亡。HK通過與VDAC結(jié)合，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，阻止凋亡的啟動(dòng)。

此外，無論在離體線粒體還是在重組的雙分子層中，當(dāng)VDAC1殘基突變時(shí)，HK-Ⅰ和VDAC1的結(jié)合均被抑制，同時(shí)HK-Ⅰ的抗凋亡活性也減弱，表明HK-Ⅰ通過和VDAC1相互作用進(jìn)行凋亡的調(diào)節(jié)。

2.2VDAC與Bcl-2家族蛋白Bcl-2家族是凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白，控制線粒體外膜對細(xì)胞色素C和其他凋亡因子的通透性，主要包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xl等,而促凋亡蛋白包括Bax、Bak或促凋亡的BH-3 only蛋白(如Bim、Puma、Bid)，可刺激凋亡因子釋放。研究表明，Bcl-2家族蛋白對凋亡的調(diào)節(jié)是通過與VDAC相互作用進(jìn)行的。VDAC1敲除的細(xì)胞中，順氯氨鉑誘導(dǎo)的Bax激活被抑制，卻不影響B(tài)ak激活，說明凋亡通路中，VDAC1在Bak的下游，Bax的上游。而 Bax-VDAC相互作用參與了姜黃素誘導(dǎo)的Bax線粒體轉(zhuǎn)位，這可被VDAC抑制劑4，4′-二異硫氰基芪-2，2′-基二磺酸阻斷，而抗VDAC抗體可抑制Bax和Bim誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C釋放。同時(shí)也有學(xué)者報(bào)道，與VDAC1 N末端結(jié)構(gòu)域一致的VDAC1基肽，以濃度和時(shí)間依賴的方法，與Bcl-2相互作用，抑制了它的抗凋亡活性[2]。

2.3VDAC與細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)Ca2+是線粒體通透性改變的基礎(chǔ)，Ca2+超載導(dǎo)致線粒體外膜腫脹破裂，接著細(xì)胞色素C和其他的促凋亡蛋白釋放。而VDAC對Ca2+高度通透，調(diào)節(jié)Ca2+進(jìn)入內(nèi)膜間隙參與線粒體通透性改變，Keinan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在VDAC上存在Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)VDAC開放時(shí)，Ca2+經(jīng)VDAC流入線粒體，導(dǎo)致線粒體腫脹、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，凋亡發(fā)生，而釕紅、鑭離子(La3+)也可結(jié)合該位點(diǎn)，抑制Ca2+內(nèi)流產(chǎn)生凋亡抑制效應(yīng)。Huang等[22]認(rèn)為，VDAC和Bcl-xL相互作用促進(jìn)線粒體Ca2+的吸收。因此，VDAC作為Ca2+進(jìn)出線粒體的通道，在鈣穩(wěn)態(tài)維持和細(xì)胞活性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

2.4VDAC和活性氧類介導(dǎo)的凋亡活性氧類可激動(dòng)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放[23]，但活性氧類通過線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制及其激動(dòng)細(xì)胞色素C釋放的分子機(jī)制仍不清楚。超氧陰離子(O2-)誘導(dǎo)的凋亡可被4，4′-二異硫氰基芪-2，2′-二磺酸和抗VDAC抗體抑制，表明O2-是通過VDAC誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放的，此外，在VDAC重組的脂質(zhì)體中也獲得的相似的結(jié)果。研究還發(fā)現(xiàn)，O2-可誘導(dǎo)VDAC表達(dá)上調(diào)，而活性氧類螯合劑沒食子兒茶素可抑制這種效應(yīng)。

3VDAC和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病

VDAC參與了阿爾茨海默病的病理形成過程，但它的準(zhǔn)確機(jī)制卻不清楚，有可能參與了β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的毒性。在阿爾茨海默病患者的腦中，VDAC在穴樣內(nèi)陷的細(xì)胞膜中很豐富，因此認(rèn)為VDAC可能與阿爾茨海默病神經(jīng)病理性膜功能紊亂有關(guān)[24]。而對唐氏綜合征患者的尸檢發(fā)現(xiàn)，VDAC1表達(dá)增加。在癲癇老鼠的海馬中，VDAC1水平增加了3倍，而VDAC2降低到原來的1/4[25]。在家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥的形成過程中，VDAC2發(fā)生了翻譯后修飾的改變[26]，且在一些患者中，過氧化物歧化酶1發(fā)生了突變，與VDAC結(jié)合后，降低了它的通道傳導(dǎo)性。Premkumar和Simantov[27]發(fā)現(xiàn)，多巴胺能降低NMB細(xì)胞中VDAC的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)VDAC后可減少多巴胺產(chǎn)生的神經(jīng)毒性。在11血管阻斷的大鼠全腦缺血模型中，胞外谷氨酸鹽釋放增加，VDAC1表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)凋亡[28]。

4VDAC和癌癥

癌癥細(xì)胞可通過不同的方法對抗凋亡，包括通過過度表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2家族和HK來抑制線粒體凋亡通路。事實(shí)上，許多化療藥發(fā)揮化療作用就是通過誘導(dǎo)線粒體凋亡實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，人癌細(xì)胞比正常細(xì)胞表達(dá)高水平VDAC1[29]，且惡性腫瘤的線粒體可更好地結(jié)合HK，增加其抗凋亡作用，因此選擇性靶作用小分子VDAC或利用VDAC與抗凋亡蛋白相互作用來促進(jìn)凋亡對抗癌藥的發(fā)展有很大的潛力。

在多種癌癥中HK和抗凋亡Bcl-2家族蛋白過表達(dá)，Bcl-2家族蛋白成員是通過與VDAC相互作用來介導(dǎo)它們的抗凋亡效應(yīng)，靶向VDAC-Bcl-2相關(guān)也可作為抗癌藥的方法。

5VDAC和骨骼肌、心肌疾病

在營養(yǎng)不良的mdx小鼠的骨骼肌中，能量代謝發(fā)生了障礙，VDAC3的mRNA顯著下調(diào)，表明VDAC3可能參與了小鼠肌肉營養(yǎng)不良的早期病理形成。在兔心肌缺血/再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，p38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑PD169316能顯著減少p38介導(dǎo)的VDAC1磷酸化，意味著VDAC1參與了心肌缺血/再灌注[30]。

VDAC參與多種疾病的病理生理發(fā)展主要源于VDAC調(diào)節(jié)能量代謝，介導(dǎo)胞質(zhì)和線粒體的對話以及對凋亡調(diào)節(jié)。

6小結(jié)

VDAC作為線粒體與胞質(zhì)的分界，是線粒體與胞質(zhì)之間物質(zhì)交換的屏障以及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)或電生理信號(hào)的作用位點(diǎn)，在調(diào)節(jié)線粒體代謝及與細(xì)胞的其他部分聯(lián)系中起關(guān)鍵作用，通過與多種因子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，因此VDAC有可能成為藥物作用的新靶點(diǎn)。盡管已經(jīng)能檢測VDAC1重組體的高分辨率結(jié)構(gòu)，但仍然有許多問題未知，如調(diào)質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的定位、各種VDAC亞型的具體功能及參與的疾病等，需要更深入的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Shoshan-Barmatz V,Ben-Hail D.VDAC,a multi-functional mitochondrial protein as a pharmacological target[J].Mitochondrion,2012,12(1):24-34.

[2]Arbel N,Shoshan-Barmatz V.Voltage-dependent anion Channel 1-based peptides interact with Bcl-2 to prevent antiapoptotic acti-vity[J].J Biol Chem,2010,285(9):6053-6062.

[3]Yu Z,Liu N,Li Y,etal.Neuroglobin overexpression inhibits oxygen-glucose deprivation-induced mitochondrial permeability transition pore opening in primary cultured mouse cortical neurons[J].Neurobiol Dis,2013,56:95-103.

[4]De Pinto V,Guarino F,Guarnera A,etal.Characterization of human VDAC isoforms:a peculiar function for VDAC3?[J].Biochim Biophys Acta,2010,1797(6/7):1268-1275.

[5]Anflous-Pharayra K,Lee N,Armstrong DL,etal.VDAC3 has differing mitochondrial functions in two types of striated muscles[J].Biochim Biophys Acta,2011,1807(1):150-156.

[6]Wu S,Sampson MJ,Decker WK,etal.Each mammalian mitochondrial outer membrane porin protein is dispensable:effects on cellular respiration[J].Biochim Biophys Acta,1999,1452(1):68-78.

[7]Sampson MJ,Decker WK,Beaudetal,etal.Immotile sperm and infertility in mice lacking mitochondrial voltage-dependent anion Channel type 3[J].J Biol Chem,2001,276(42):39206-39212.

[8]Gauci S,Helbig AO,Slijper M,etal.Lys-N and trypsin cover complementary parts of the phosphoproteome in a refined SCX-based approach[J].Anal Chem,2009,81(11):4493-4501.

[9]Choudhary C,Kumar C,Gnad F,etal.Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions[J].Science,2009,325(5942):834-840.

[10]Mihara K,Sato R.Molecular cloning and sequencing of cDNA for yeast porin,an outer mitochondrial membrane protein:a search for targeting signal in the primary structure[J].Embo J,1985,4(3):769-774.

[11]Ujwal R,Cascio D,Colletier JP,etal.The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(46):17742-17747.

[12]Bayrhuber M,Meins T,Habeck M,etal.Structure of the human voltage-dependent anion channel[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(40):15370-15375.

[13]Hiller S,Garces RG,Malia TJ,etal.Solution structure of the integral human membrane protein VDAC-1 in detergent micelles[J].Science,2008,321(5893):1206-1210.

[14]Shoshan-Barmatz V,Golan M.Mitochondrial VDAC1:function in cell Life and death and a target for Cancer therapy[J].Curr Med Chem,2012,19(5):714-735.

[15]De Stefani D,Bononi A,Romagnoli A,etal.VDAC1 selectively transfers apoptotic Ca2+signals to mitochondria[J].Cell Death Differ,2012,19(2):267-273.

[16]Shoshan-Barmatz V,De Pinto V,Zweckstetter M,etal.VDAC,a multi-functional mitochondrial protein regulating cell Life and death[J].Mol Aspects Med,2010,31(3):227-285.

[17]Yuan S,Fu Y,Wang X,etal.Voltage-dependent anion Channel 1 is involved in endostatin-induced endothelial cell apoptosis[J].FASEB J,2008,22(8):2809-2820.

[18]Tomasello F,Messina A,Lartigue L,etal.Outer membrane VDAC1 controls permeability transition of the inner mitochondrial membrane in cellulo during stress-induced apoptosis[J].Cell Res,2009,19(12):1363-1376.

[19]Zaid H,Abu-Hamad S,Israelson A,etal.The voltage-dependent anion channel-1 modulates apoptotic cell death[J].Cell Death Differ,2005,12(7):751-760.

[20]Godbole A,Varghese J,Sarin A,etal.VDAC is a conserved element of death pathways in plant and animal systems[J].Biochim Biophys Acta,2003,1642(1/2):87-96.

[21]Keinan N,Pahima H,Ben-Hail D,etal.The role of Calcium in VDAC1 oligomerization and mitochondria-mediated apoptosis[J].Biochim Biophys Acta,2013,1833(7):1745-1754.

[22]Huang H,Hu X,Eno CO,etal.An interaction between Bcl-xL and the voltage-dependent anion channel(VDAC) promotes mitochondrial Ca2+uptake[J].J Biol Chem,2013,288(27):19870-

19881.

[23]Mccommis KS,Baines CP.The role of VDAC in cell death:friend or foe?[J].Biochim Biophys Acta,2012,1818(6):1444-1450.

[24]Ramírez CM,González M,Díaz M,etal.VDAC and ERalpha interaction in caveolae from human cortex is altered in Alzheimer′s disease[J].Mol Cell Neurosci,2009,42(3):172-183.

[25]Jiang W,Du B,Chi Z,etal.Preliminary explorations of the role of mitochondrial proteins in refractory epilepsy:some findings from comparative proteomics[J].J Neurosci Res,2007,85(14):3160-

3170.

[26]Fukada K,Zhang F,Vien A,etal.Mitochondrial proteomic analysis of a cell line model of familial amyotrophic lateral sclerosis[J].Mol Cell Proteomics,2004,3(12):1211-1223.

[27]Premkumar A,Simantov R.Mitochondrial voltage-dependent anion Channel is involved in dopamine-induced apoptosis[J].J Neurochem,2002,82(2):345-352.

[28]Park E,Lee GJ,Choi S,etal.The role of glutamate release on voltage-dependent anion channels (VDAC)-mediated apoptosis in an eleven vessel occlusion model in rats[J].PLoS One,2010,5(12):e15192.

[29]Simamura E,Shimada H,Hatta T,etal.Mitochondrial voltage-dependent anion channels(VDACs) as novel pharmacological targets for anti-cancer agents[J].J Bioenerg Biomembr,2008,40(3):213-217.

[30]Schwertz H,Carter JM,Abdudureheman M,etal.Myocardial ischemia/reperfusion causes VDAC phosphorylation which is reduced by cardioprotection with a p38 MAP kinase inhibitor[J].Proteomics,2007,7(24):4579-4588.

Research Progress in Voltage-dependent Anion ChannelDAIQiong-yan，DUANMan-lin.(DepartmentofAnesthesia，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，Nanjing210002，China)

Abstract:Found at the outer mitochondrial membrane,the voltage-dependent anion channel(VDAC) forms the main interface between the mitochondria and cellular metabolisms,thus functions as a gatekeeper,controlling cross-talk between mitochondria and the rest of the cell.Meanwhile,VDAC has also been recognized as a key protein in mitochondria-mediated apoptosis.In addition to regulating the metabolic and energetic functions of mitochondria,VDAC appears to be a convergence point for cell survival and cell death signals via its association with various ligands and proteins,making it to be a rational target for new therapeutics.Here is to make a review of mammalian VDAC,especially VDAC1,addressing its structure,functions,the relationship between associated proteins and its involvement in several diseases.

Key words：Voltage-dependent anion channel; Mitochondria; Apoptosis

收稿日期：2014-09-28修回日期：2014-12-23編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.13.011

中圖分類號(hào)：R966

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)13-2332-03