劉亞軍(綜述),張先啟，官建中(審校)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 蚌埠 233000)

骨折愈合的基因治療進(jìn)展

劉亞軍(綜述),張先啟，官建中※(審校)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 蚌埠 233000)

摘要：骨折愈合是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)修復(fù)過程，目前已發(fā)現(xiàn)多種促進(jìn)骨折愈合的物質(zhì)，其中研究較多的為生長(zhǎng)因子。近年來，由于基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過基因技術(shù)將相關(guān)的目的基因通過載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過表達(dá)特定的生長(zhǎng)因子蛋白促進(jìn)骨折愈合為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。國內(nèi)外大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)基因治療可以促進(jìn)骨折的愈合，為骨折愈合提供了新的途徑。

關(guān)鍵詞：骨折；骨缺損；愈合；基因治療

臨床上，骨不愈合、骨延遲愈合、骨缺損一直是困擾人們的難題，人們?cè)谶@方面作了大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子在骨折愈合過程中起重要作用，但是在正常情況下，骨折端的含量相當(dāng)?shù)停蛔阋园l(fā)揮最大效能，于是，采用骨折端周圍局部應(yīng)用外源性生長(zhǎng)因子來促進(jìn)骨折愈合越來越引起人們的重視。但是，重組生長(zhǎng)因子蛋白制備困難、產(chǎn)量少，價(jià)格高，局部應(yīng)用時(shí)降解較快，并可產(chǎn)生相應(yīng)的不良反應(yīng)[1]，限制了重組生長(zhǎng)因子在臨床上的廣泛應(yīng)用。近年來，由于基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因治療在骨折愈合中的應(yīng)用也得到了廣泛的研究，現(xiàn)就基因治療對(duì)骨折愈合的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1目的基因的選擇

骨折愈合的不同時(shí)段會(huì)有不同的生長(zhǎng)因子表達(dá)，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(bone morphogenetic protein，BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等，盡管這些生長(zhǎng)因子在體內(nèi)水平很低，但對(duì)骨折的愈合有著深遠(yuǎn)的影響[2]，經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者的大量研究，發(fā)現(xiàn)它們可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖分化。目前由于基因工程的發(fā)展，這些生長(zhǎng)因子相關(guān)基因已被成功地克隆，被成功地轉(zhuǎn)染到相關(guān)載體中，通過載體轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，由靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成信使RNA并翻譯成重組生長(zhǎng)因子蛋白，促進(jìn)骨折的愈合。

2基因治療載體的選擇

基因治療載體可分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、皰疹病毒、慢病毒載體等[3]。目前實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最為廣泛的病毒載體為腺病毒載體，腺病毒載體為一種裸露的DNA分子病毒。由于其可以瞬時(shí)高效表達(dá)、毒性較低、制備簡(jiǎn)單，在基因治療中有著廣泛的應(yīng)用[4]。腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是一種無被膜的、線性單鏈的動(dòng)物DNA病毒之一，直徑約為20 nm。AAV基因組是一個(gè)線性、單鏈DNA分子，大小約為4.7 kb[5]。AAV具有無致病性、低免疫原性、能長(zhǎng)期表達(dá)、能感染多種細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)[6]，被廣泛地用于基因載體，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年來，慢病毒載體被廣泛地應(yīng)用于各類基因治療的實(shí)驗(yàn)研究中，慢病毒載體包含兩條單鏈線性RNA分子，慢病毒載體是在人免疫缺陷病毒1型的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的，能利用宿主的反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶將自身的RNA分子轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA分子整合到宿主細(xì)胞的染色體中，可以使目的基因能在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期而較穩(wěn)定的表達(dá)[7]。非病毒載體主要有質(zhì)粒、陽離子多聚物載體、納米顆粒載體、脂質(zhì)體載體等。非病毒載體相比病毒載體具有低免疫原性、低成本、易制備等特點(diǎn)，但同時(shí)非病毒載體較病毒載體有低效率、表達(dá)時(shí)間短、保存不穩(wěn)定等問題[8]。

3靶細(xì)胞的選擇

為了讓目的基因能有效的表達(dá)，靶細(xì)胞的選擇非常重要，靶細(xì)胞又稱為受體細(xì)胞，是接受目的基因的細(xì)胞，來源于被治療的對(duì)象，選擇靶細(xì)胞的原則是：①必須耐以處理，并易于從人體分離又便于輸回到體內(nèi)；②具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期較長(zhǎng)；③易于受外源基因的轉(zhuǎn)化?？紤]到基因治療的全身治療不良反應(yīng)，盡量采用骨折端局部的細(xì)胞作為靶細(xì)胞，故骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等在實(shí)驗(yàn)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于骨髓基質(zhì)的一類干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以較方便地從骨髓中抽取，并容易在體外擴(kuò)增，并擁有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力，可分化為多種細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，擁有廣闊的發(fā)展前景[9]。

4目的基因的導(dǎo)入方式

目的基因?qū)氚屑?xì)胞可分為體外導(dǎo)入、體內(nèi)導(dǎo)入。體外導(dǎo)入是將目的基因先導(dǎo)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，再將帶有目的基因的細(xì)胞回輸入體內(nèi)，其操作過程較為復(fù)雜，但相對(duì)較安全。體內(nèi)導(dǎo)入是把目的基因直接導(dǎo)入宿主靶細(xì)胞，技術(shù)要求相對(duì)簡(jiǎn)單。

5基因治療

5.1單基因治療

5.1.1BMP基因BMP是由Urist在1965年首次發(fā)現(xiàn)的，通過國內(nèi)外學(xué)者的大量研究，BMP共發(fā)現(xiàn)至少40多種亞型，且這個(gè)數(shù)量仍在不斷增加，表達(dá)于不同生物不同組織中，除BMP-1以外其余均屬于TGF-β超家族[10]。BMP是一類具有修復(fù)和調(diào)節(jié)作用的生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)骨折愈合中發(fā)揮重要的作用，在促進(jìn)骨折愈合方面,人們研究較多的是BMP-2、BMP-4和BMP-7,其中BMP-2的活性最強(qiáng)[11]。目前有20多種BMP基因已被成功地克隆，并被國內(nèi)外學(xué)者成功地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中，促進(jìn)骨折的愈合。焦鯤等[12]制備整合有BMP-2基因的腺病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到鼠的肌母細(xì)胞中并成功表達(dá)，建立大鼠脛骨骨缺損小鼠模型,以膠原海綿為支架，植入到骨缺損處，并設(shè)立未轉(zhuǎn)染的支架植入作為對(duì)照組，術(shù)后3、6、9周通過影像學(xué)、組織學(xué)、生物力學(xué)檢測(cè)，得出轉(zhuǎn)染組骨缺損修復(fù)能力明顯增強(qiáng)。Shi等[13]制備含有BMP-4 基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到兔脂肪來源的干細(xì)胞中，并接種到含有聚乳酸-乙醇酸的支架中，植入到兔缺損的關(guān)節(jié)軟骨處，并設(shè)立未轉(zhuǎn)染的支架植入作為對(duì)照組，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組缺損處的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)速度明顯增加。Zhu等[14]制備含有BMP-7基因的腺病毒載體并轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，并與珊瑚黏附植入到羊的股骨缺損模型作為試驗(yàn)組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與珊瑚黏附植入羊的股骨缺損作為對(duì)照組。第4、8周進(jìn)行影像學(xué)和生物力學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示試驗(yàn)組可以明顯促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。

5.1.2TGF-β基因TGF-β是一族具有多種功能的蛋白多肽，有五種亞型被發(fā)現(xiàn)，廣泛地存在于多種組織及多種細(xì)胞中，其中以骨組織、血小板、軟骨組織中含量最為豐富。目前對(duì)TGF-β家族研究較多的是TGF-β1，體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)TGF-β1的應(yīng)用可促進(jìn)骨折的愈合[15]。易誠青等[16]體外培養(yǎng)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell，BMSCs)，以脂質(zhì)體介導(dǎo)TGF-β1基因轉(zhuǎn)染到BMSCs，建立兔橈骨缺損模型，黏附于生物衍生型復(fù)合移植體GP-DPB，并植入橈骨缺損的模型中，并設(shè)立不含有TGF-β1基因轉(zhuǎn)染的GP-DPB植入橈骨缺損作為對(duì)照組，第4、8、12周行組織學(xué)、影像學(xué)、生物力學(xué)測(cè)試，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組有更強(qiáng)的骨缺損修復(fù)能力。

5.1.3IGF基因IGF分為IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，IGFs是一種分子結(jié)構(gòu)上與胰島素相似的多肽蛋白物質(zhì)，IGF由生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)，同時(shí)能介導(dǎo)生長(zhǎng)激素促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)的作用[17]。鄭浩等[18]將人IGF-Ⅰ 基因轉(zhuǎn)染到成肌細(xì)胞后，建立小鼠骨折模型，實(shí)驗(yàn)組在骨折處周圍肌內(nèi)多點(diǎn)注射0.3 mL 轉(zhuǎn)人IGF-Ⅰ 基因的成肌細(xì)胞懸液；對(duì)照組只注射0.3 mL 生理鹽水。第2、3、4周后行組織學(xué)、影像學(xué)、骨密度測(cè)試顯示，實(shí)驗(yàn)組骨折愈合速度明顯快于對(duì)照組。

5.1.4FGF基因FGF 有兩種形式，分別是aFGF和bFGF?？纱龠M(jìn)成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞增殖分化的能力，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)bFGF在促進(jìn)骨折愈合方面要強(qiáng)于aFGF[19]。 目前研究較多的是bFGF基因。王小志等[20]將含有bFGF基因轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，并黏附于同種異體骨中，植入羊的髂骨缺損處作為實(shí)驗(yàn)組，并建立不含有bFGF 基因轉(zhuǎn)染的同種異體支架骨材料、β-磷酸三鈣材料作為對(duì)照組，第4、8、12周行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)染色觀察，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組具有更強(qiáng)的骨缺損修復(fù)能力。賈祎佳等[21]將含有bFGF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并用生物活性玻璃作為可吸附載體,將其植入到兔橈骨骨缺損處,并以自體骨移植組、生物活性玻璃組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組和空白組作為對(duì)照,第2、4、8、12周進(jìn)行影像學(xué)、組織學(xué)、生物力學(xué)測(cè)試,觀察各組骨缺損修復(fù)效果。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組成骨能力、骨愈合后的抗彎能力明顯強(qiáng)于其他各組。

5.1.5VEGF基因VEGF是一種具有肝素活性的生長(zhǎng)因子，可特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管細(xì)胞的再生，是誘導(dǎo)骨細(xì)胞增殖的一種較強(qiáng)的生長(zhǎng)因子[22]。徐輝等[23]將VEGF基因與腺相關(guān)病毒重組，并與無機(jī)骨顆粒復(fù)合植入到兔顱骨缺損模型作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組僅填充不含有轉(zhuǎn)染的無機(jī)骨顆粒。第2、4、8周行組織學(xué)、影像學(xué)觀察，顯示實(shí)驗(yàn)組具有更強(qiáng)的成骨能力、更強(qiáng)的修復(fù)骨缺損能力。

5.2多基因的聯(lián)合治療由于骨折愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，由多種生長(zhǎng)因子共同作用，并協(xié)同表達(dá)。許多國內(nèi)外學(xué)者開始轉(zhuǎn)向多種基因聯(lián)合作用治療骨折及骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究。Lu等[24]利用桿狀病毒將TGF-β3基因和BMP-6基因轉(zhuǎn)染到脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASCs)，并培養(yǎng)在多孔支架中，將其植入兔的軟骨缺損處，并設(shè)立只含有TGF-β3或BMP-6轉(zhuǎn)染的ASCs作為對(duì)照組，并設(shè)立陰性對(duì)照組，第6、12周后行組織學(xué)檢測(cè)，提示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組具有更強(qiáng)的軟骨修復(fù)能力，TGF-β3基因和BMP-6基因共同作用時(shí)具有協(xié)同作用。Zhang等[25]利用腺病毒將血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)基因、BMP-7基因轉(zhuǎn)染到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并制成大鼠骨質(zhì)疏松的股骨缺損模型，黏附于介孔生物玻璃/真絲纖維蛋白支架中，并植入股骨缺損模型，并設(shè)立只含有PDGF或BMP-7基因轉(zhuǎn)染的對(duì)照組。第4、8周行影像學(xué)、組織學(xué)、生物力學(xué)測(cè)試，結(jié)果顯示PDGF、BMP-7基因的聯(lián)合應(yīng)用較單獨(dú)應(yīng)用具有更高的成骨能力。Samee等[26]利用非病毒載體將BMP-2基因和VEGF基因轉(zhuǎn)染到鼠的骨膜細(xì)胞中，并植入到鼠的肌肉內(nèi)作為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)有只含有BMP-2基因或VEGF基因轉(zhuǎn)染的骨膜細(xì)胞植入作為對(duì)照組，術(shù)后4周測(cè)定各組堿性磷酸酶活性及堿性磷酸酶活性基因表達(dá)，得出實(shí)驗(yàn)組具有更強(qiáng)的成骨能力，BMP-2基因和VEGF基因具有協(xié)同促進(jìn)骨細(xì)胞再生的作用。王體俊等[27]建立含有TGF-β3和BMP-2 基因及綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染到兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，并建立只轉(zhuǎn)染攜帶TGF-β3或BMP-2單一基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后1周反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白印跡結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞TGF-β3和BMP-2的信使RNA和蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組，得出兩種基因具有協(xié)同促表達(dá)作用。Madry等[28]構(gòu)建含有大腸埃希菌lacZ基因、IGF-Ⅰ基因、 bFGF-2 基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞后，植入到鼠的軟骨缺損處，作為實(shí)驗(yàn)組，并建立只含有單基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞植入作為對(duì)照組，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組3周后具有更強(qiáng)的軟骨修復(fù)能力。

6展望

利用基因治療骨折、骨缺損修復(fù)在實(shí)驗(yàn)研究已開展多年，取得了相應(yīng)的成果，但基因治療面向臨床仍然有許多棘手問題有待解決，例如外源基因在體內(nèi)表達(dá)安全性問題。由于骨折通常是非致死性的，這使得患者和醫(yī)師不愿采用基因治療的方法。為了緩解安全問題，潛在的免疫反應(yīng)系統(tǒng)的評(píng)估和非毒性的載體的研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。另外，昂貴的醫(yī)療費(fèi)用問題及倫理道德問題等也需要人們考慮，但隨著生物技術(shù)領(lǐng)域的持續(xù)發(fā)展，基因治療骨折、骨缺損修復(fù)的應(yīng)用必然會(huì)轉(zhuǎn)向臨床，必然有廣闊的應(yīng)用前景。

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Advances in Gene Therapy for Fracture Healing

LIUYa-jun,ZHNAGXian-qi，GUANJian-zhong.

(DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege，Bengbu233000，China)

Abstract:Fracture healing is an extremely complex biological repair process,and so far a variety of substances has been found to promote fracture healing,among which the growth factors are more studied.In recent years,due to the development of genetic engineering and molecular biology technology,transducting the target gene into target cells by a carrier to promote healing through the expression of specific growth factor is currently a hot spot in the research field.A large number of domestic and international experiments confirmed that the gene therapy can promote fracture healing, providing a new way for fracture healing.

Key words:Fracture; Bone defect; Healing; Gene therapy

收稿日期：2014-07-21修回日期：2014-10-23編輯：樓立理

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.025

中圖分類號(hào)：R683； Q812

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)10-1796-04