崔秀秀，張義賢

山西大學生命科學學院，太原 030006

Ni脅迫對不同基因型谷子幼苗生長及氮素代謝的影響

崔秀秀，張義賢*

山西大學生命科學學院，太原 030006

采用盆栽土培法，研究了不同濃度Ni2+(0、25、50、100、150、200 mg/kg)對4種基因型谷子(13- 36、B- 7、晉谷51號、晉谷52號)幼苗生長，Ni2+富集與轉(zhuǎn)運能力，葉片中硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸含量及氮代謝相關(guān)酶硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷氨酸脫氫酶(GDH)活性的影響。結(jié)果表明：Ni2+脅迫下，4種基因型谷子幼苗的根長、苗長、生物量隨Ni2+濃度增加逐漸降低，體內(nèi)Ni2+含量逐漸增加，與對照組差異顯著(P<0.05)。在所試濃度范圍內(nèi)，4種基因型谷子幼苗葉片中的硝態(tài)氮含量、NR、GS、GOGAT活性表現(xiàn)為低濃度(25—50mg/kg)增高和高濃度(50—200 mg/kg)降低，而GDH活性在Ni2+濃度為100mg/kg以上時下降，氨態(tài)氮含量在50—150 mg/kg處理組中為對照的1.14—3.02倍。不同濃度Ni2+處理后，4種基因型谷子幼苗葉片中的脯氨酸含量均有不同程度的提高，而可溶性蛋白質(zhì)含量呈明顯下降趨勢。實驗結(jié)果證明，Ni2+脅迫抑制了谷子幼苗對硝態(tài)氮的吸收，降低了葉片中NR、GS、GOGAT活性，影響了氨的同化作用，使谷子幼苗的氮素代謝發(fā)生紊亂，不同基因型谷子對Ni2+脅迫的毒性效應存在差異。4種基因型谷子對Ni2+的耐性順序為13- 36>B- 7>晉谷51>晉谷52。

谷子；Ni脅迫；生長響應；氮素代謝

鎳(Ni)是一種廣泛分布的重金屬元素，由于現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，采礦、冶煉、電鍍等廢棄物的產(chǎn)生，以及污泥和復合堆肥的使用，Ni已成為農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境中的重要污染物[1]。研究表明，Ni是植物生長的必需微量元素之一，微量的鎳能夠促進種子萌發(fā)和幼苗的生長，延緩植物衰老[2]。鎳還是脲酶的金屬輔基，參與植物的氮素代謝，改善植物對氮素的利用率[3]。但過量的鎳能阻滯植物的生長，使植物葉片卷曲，黃化，甚至死亡，還會干擾植物體內(nèi)正常的物質(zhì)代謝[4]。氮是植物生長發(fā)育中不可缺少的營養(yǎng)元素，氮素代謝也是植物重要的營養(yǎng)代謝之一[5]，氮素代謝會影響植物的代謝、資源分配及生長和發(fā)育[6]。Ni脅迫可以通過抑制植物體內(nèi)氮素代謝相關(guān)酶的活性，減少植物對氮的吸收與轉(zhuǎn)運，引起氮代謝的變化[7]。

谷子(Setariaitalica(L.) Beauv)是一種起源于我國的特色禾谷類糧飼兼用作物，具有耐旱、耐瘠、營養(yǎng)豐富等特點，其蛋白質(zhì)含量明顯高于小麥、玉米和水稻等作物。在谷子生長發(fā)育和產(chǎn)量的形成中，需要吸收氮、磷、鉀等多種營養(yǎng)元素，其中氮對谷子產(chǎn)量的作用最大[8]。目前，國內(nèi)外有關(guān)重金屬脅迫對谷子毒性影響的研究已有一些報道，Rout等[9]研究了Ni2+對谷子愈傷組織生長及蛋白質(zhì)合成的抑制效應。肖志華等[10]研究了不同濃度Pb2+、Cu2+脅迫對谷子幼苗的葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)及DNA含量的影響。張義賢等[11- 12]研究了Cu2+、Pb2+脅迫對不同基因型谷子幼苗基因組DNA多態(tài)性的影響。張喜文等[13]研究了谷子幼苗對土壤Pb2+、Cr3+的生長響應及吸收積累的差異性。而有關(guān)Ni2+對谷子幼苗生長及氮素代謝的研究報道甚少。本實驗采用盆栽土培法，研究了外源Ni2+脅迫下4種基因型谷子幼苗生長、生物量、葉片中含氮物質(zhì)、氮代謝關(guān)鍵酶活性的變化及Ni2+吸收積累特性，以期了解鎳污染對谷子幼苗生長發(fā)育的影響，探討鎳對谷子氮素代謝的毒害機制，比較不同基因型谷子幼苗對鎳毒害的耐性差異，為重金屬污染地區(qū)谷子的栽培管理及谷子品質(zhì)改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以山西省農(nóng)科院谷子研究所提供的13- 36、B- 7、晉谷51號、晉谷52號4種基因型谷子(Setariaitalica(L.) Beauv)為試驗材料。供試土壤為褐土，取自山西省農(nóng)科院試驗田0—20cm的表層土。土壤pH值為7.2，有機質(zhì)含量為8.3g/kg，全氮含量為0.9mg/kg，速效P、K含量分別25.2、68.6 mg/kg，鎳含量為12.52mg/kg，土壤含水量為31.2%。試驗所用外源鎳為NiCl2·6H2O(分析純)。

1.2 試驗處理

Ni2+處理濃度的設置參照我國農(nóng)田土壤環(huán)境質(zhì)量標準[14]中Ni2+污染臨界值，用NiCl2·6H2O配制成25、50、100、150、200mg/kg(以純Ni2+計)5個Ni2+濃度溶液，以去離子水作為對照。將配置好的Ni2+溶液分別加入裝有2 kg土壤的陶瓷盆中(20cm×20cm)，充分混勻后放置20d備用。精選籽粒飽滿、大小均勻的谷子種子，用5%的NaClO消毒30min后洗凈，放置在26℃培養(yǎng)箱中避光發(fā)芽。將萌發(fā)后的種子種于盆中，每盆50粒，在室內(nèi)條件下培養(yǎng)30d后取樣測試各指標，晝/夜溫度為27℃/20℃，濕度為30%—50%，每天定時補充水分，以稱重法確定失水量，每一處理設置3個重復。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生物量及Ni含量的測定

將培養(yǎng)30d的谷子幼苗整株取出，用去離子水洗凈，然后將根浸入20mmol/L的EDTA-Na2溶液中交換20min，以去除根系表面吸附的Ni2+，再用去離子水洗凈，吸水紙吸干表面水分，測量幼苗的根長、苗長(cm)。將谷子幼苗置于70℃烘箱中烘干至恒重，隨機選取10株幼苗，稱生物量(mg)(以平均值計)。根系耐性指數(shù)(RTI)[10]:

RTI=各處理的根長(cm)/對照的根長(cm)

另將烘干的谷子幼苗分為地上、地下兩部分，研磨，分別稱取0.1g，經(jīng)4∶1 HNO3-HClO4消化，去離子水定容后用原子吸收分光光度計(SHIMADZU AA- 6300型)測定各樣品中的Ni2+含量(mg/kg)[10]。

富集系數(shù)=植株地上部的重金屬含量(mg/kg)/土壤中重金屬含量(mg/kg)

轉(zhuǎn)運系數(shù)=植株地上部的重金屬含量(mg/kg)/根部的重金屬含量(mg/kg)

1.3.2 氨態(tài)氮、硝態(tài)氮、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸含量的測定

選取谷子幼苗的新鮮葉片進行含氮物質(zhì)的測定。其中，氨態(tài)氮含量的測定參照中國科學院上海植物生理研究所的方法[15]；硝態(tài)氮含量的測定采用硝基水楊酸比色法[16]，410nm波長下測定吸光度；可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍G- 250染色法[16]；游離脯氨酸含量的測定采用磺基水楊酸法[16]。

1.3.3 酶的提取與活性測定

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel進行計算，并用SPSS 16.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ni2+脅迫對不同基因型谷子幼苗生長及生物量的影響

表1顯示，與對照組相比，4種基因型谷子幼苗的根長、苗長、生物量隨Ni2+處理濃度的增加逐漸下降，在200mg/kg時降至最低，與對照差異顯著(P<0.05)。其中晉谷52受Ni2+脅迫的影響最大，植株長度和生物量分別比對照下降了34.2%和34.3%。在所試Ni2+濃度范圍內(nèi)，4種基因型谷子幼苗的根系耐性指數(shù)均小于對照組，表明Ni2+脅迫對谷子幼苗的根系生長有明顯抑制作用。13- 36、B- 7、晉谷51、晉谷52對Ni2+的平均耐性指數(shù)分別為0.618、0.658、0.566、0.562，不同基因型之間差異顯著(P<0.05)，4種基因型谷子對Ni2+的耐性大小為B- 7>13- 36>晉谷51>晉谷52。

2.2 Ni2+在不同基因型谷子幼苗體內(nèi)的吸收積累與遷移

富集系數(shù)(BCF)和轉(zhuǎn)運系數(shù)(TF)能夠反映植物對土壤中重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運能力[17]。由表2可知，不同濃度Ni2+處理下，4種基因型谷子幼苗地上部、根部中Ni2+含量隨處理濃度的升高逐漸增加，與對照差異顯著(P<0.05)。在所試Ni2+處理濃度范圍內(nèi)，幼苗根部的Ni2+含量均明顯高于地上部，表明Ni2+進入谷子幼苗體內(nèi)主要積累在根部。從谷子幼苗對Ni2+的富集能力看，不同基因型間存在差異(P<0.05)，4種谷子對Ni2+的富集能力為晉谷51>13- 36>B- 7>晉谷52。Ni2+由根部向地上部的轉(zhuǎn)運能力也存在差異，4種谷子的轉(zhuǎn)運能力為13- 36>B- 7>晉谷51>晉谷52。

表1 Ni2+對不同基因型谷子幼苗生長及生物量的影響Table 1 Effects of the growth and biomass on different genotypes foxtail millet seedlings under Ni2+ stress

同列相同基因型不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同濃度不同基因型不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)

表2 Ni2+在不同基因型谷子幼苗體內(nèi)的吸收、積累與遷移Table 2 The uptake，accumulation and transformation of Ni2+ in different genotypes foxtail millet Seedlings

2.3 Ni2+脅迫對不同基因型谷子幼苗硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、游離脯氨酸及可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由表3可以看出，在低濃度(25—50 mg/kg)Ni2+處理組中，4種基因型谷子幼苗葉片中硝態(tài)氮的含量逐漸上升，與對照相比差異顯著(P<0.05)。當Ni2+處理濃度>50 mg/kg時，4種谷子葉片中硝態(tài)氮含量逐漸下降。4種基因型谷子葉片中的硝態(tài)氮含量為13- 36>B- 7>晉谷51>晉谷52。Ni2+處理下，4種谷子幼苗葉片中氨態(tài)氮含量隨處理濃度的升高先增加后減少，在50—100 mg/kg范圍內(nèi)為對照的1.14—3.02倍，且不同處理組間差異顯著(P<0.05)，其中晉谷52葉片中氨態(tài)氮含量明顯高于其他3種基因型。

表3 Ni2+脅迫對不同基因型谷子幼苗硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、游離脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

Table 3 Effects of Ni2+stress on contents of nitrate，ammonium，free praline and soluble proteins in different genotypes foxtail millet Seedlings

品種Varieties添加濃度/(mg/kg)Concentration氨態(tài)氮/(μg/g)Nitrate硝態(tài)氮/(μg/g)Ammonium可溶性蛋白質(zhì)/(μg/g)Solubleprotein脯氨酸/(μg/g)Proline13-36CK338.66±0.73cC927.44±0.56bD81.13±0.35dD9.88±1.31aA25351.65±0.95dC1198.72±0.56dD79.31±1.13cdD10.41±0.05abA50381.16±0.55eC1343.57±0.05eD77.71±0.39bcD11.75±0.10bB100422.64±1.20fC1199.68±0.04dD76.12±0.96abD16.13±0.20cC150195.77±0.55bA1072.32±0.68cD76.16±1.47abD22.11±0.05dC200168.25±1.19aA828.12±0.56aD73.63±0.71aD25.40±0.30dCB-7CK423.92±0.27eD568.42±0.56dC62.45±0.48cB12.44±0.05aB25233.70±0.06aB636.10±2.01eC58.14±0.75cB13.65±0.04bB50249.35±0.04bB677.87±0.03fC56.24±0.81bcB15.55±0.04cC100292.02±1.42dA518.19±0.06cB53.23±2.67aB15.77±0.14cB150480.94±0.27fC498.43±2.01bC52.87±1.27abB23.12±0.11dD200264.23±1.52cC434.95±0.07aB51.35±0.25abB56.57±0.11eD晉谷51號Jingu51CK142.22±0.28aA534.99±0.56bB50.74±4.83bA13.49±0.03aC25331.02±0.27cC628.86±0.55dB49.12±4.39bA14.90±0.03bC50391.49±0.04eD634.56±1.24eB47.60±4.92aA15.33±0.14cC100373.99±1.00dB558.93±0.56cC43.98±2.59aA16.19±0.03dB150339.44±1.46fB487.11±0.56bB46.13±8.04aA16.33±0.05dD200198.02±0.97bB463.57±0.09aC42.84±4.14aA19.32±0.06eB晉谷52號Jingu52CK243.72±0.55dB320.40±0.27aA76.51±0.94cC9.72±0.05aA25134.38±0.82aA344.26±0.06dA73.27±1.26bC10.51±0.05aA50212.87±0.27bA361.07±0.28fA68.55±0.54aC10.97±0.08aA100736.01±1.09fD356.03±0.28eA72.53±0.80bC13.93±0.03bA150532.46±1.25eD332.69±0.28cA71.19±0.28bC14.49±1.27bA200157.14±0.27cA328.73±0.74bA70.71±0.55aC14.76±0.10bA

4種基因型谷子幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量隨著Ni2+處理濃度的增加逐漸下降，當Ni2+濃度達到200 mg/kg時降至最低，分別比對照降低了9.24%，17.77%，15.57%，7.58%。13- 36和晉谷52葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量大于B- 7和晉谷51。Ni2+脅迫下，4種基因型谷子幼苗葉片中的脯氨酸含量隨處理濃度的逐漸增加，與對照相比差異顯著(P<0.05)，且不同基因型之間存在差異(P<0.05)，13- 36和B- 7的脯氨酸含量顯著高于晉谷51和晉谷52。

2.4 Ni2+脅迫對不同基因型谷子幼苗NR、GS、GOGAT、GDH酶活性的影響

4種基因型谷子幼苗葉片中的NR活性隨著Ni2+處理濃度的增加先升高后下降(表4)，在100—150 mg/kg時為對照的1.02—1.54倍，不同基因型間差異顯著(P<0.05)。除晉谷52外，其他谷子幼苗中GS、GOGAT活性均隨Ni2+處理濃度升高先升后降，在50mg/kg時達到最大值，分別為對照的1.69、1.47、1.19倍和2.84、1.03、3.17倍。Ni2+脅迫下，4種谷子幼苗葉片中GDH活性在100 mg/kg時明顯高于對照(P<0.05)，此后逐漸下降。在25—100 mg/kg的Ni2+處理范圍內(nèi)，4種谷子葉片中GDH的活性大小為B- 7>晉谷51>晉谷52>13- 36。

表4 Ni2+脅迫對不同基因型谷子幼苗GOGAT、GS、NR、GDH酶活性的影響Table 4 Effects of Ni2+ stress on activities of GOGAT，GS，NR and GDH in different genotypes foxtail millet Seedlings

3 討論

大量研究證明，重金屬進入土壤后具有積累性和不可分解性的特征，并參與土壤和生物體的循環(huán)過程。植物通過根系將重金屬吸收進入根細胞內(nèi)，并通過細胞間的運輸向地上部轉(zhuǎn)移[10]。本研究結(jié)果表明，在所試濃度(25—200mg/kg)范圍內(nèi)，4種基因型谷子幼苗體內(nèi)的Ni2+含量顯著增加(P<0.05)，且根部含量遠高于地上部。使谷子幼苗的生長受到明顯抑制，根長、苗長顯著低于對照，直接影響到生物量的生成。4種谷子幼苗的根系耐性指數(shù)均低于對照，富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)在不同基因型間存在明顯的種內(nèi)差異。表明Ni2+雖然是植物生長的必需微量元素，但在較高濃度處理后對幼苗的生長可造成明顯的抑制和毒害效應，此結(jié)果與其他學者在小麥、玉米、水稻等作物中的研究結(jié)果相一致[17- 19]。

可溶性蛋白質(zhì)是細胞基質(zhì)及各種細胞器基質(zhì)的主要組成成分，在細胞生理代謝過程中有重要的催化功能，其含量的變化在一定程度上能反映植物氮素代謝的情況[21]。本實驗結(jié)果顯示，在50—200mg/kg Ni2+濃度范圍內(nèi)，4種基因型谷子幼苗葉片中的可溶性蛋白質(zhì)含量均有下降，B- 7和晉谷51的下降幅度大于13- 36和晉谷52，此現(xiàn)象可能與氮素吸收同化過程中關(guān)鍵酶(NR、GS、GOGAT)活性下降有關(guān)，導致無機氮向氨基酸的轉(zhuǎn)化受到抑制，從而使蛋白質(zhì)的合成受到抑制。

4 結(jié)論

(1) Ni2+脅迫使4種基因型谷子幼苗體內(nèi)的Ni2+含量增加，抑制了谷子幼苗的生長，降低了生物量。4種基因型谷子對Ni2+的耐性大小為13- 36>B- 7>晉谷51>晉谷52。

(2) 50 mg/kg以上的Ni2+處理后，4種谷子幼苗體內(nèi)硝態(tài)氮的含量均有下降，氮素代謝過程中幾種關(guān)鍵酶(NR、GS、GOGAT)活性受到抑制，使谷子幼苗體內(nèi)氨態(tài)氮積累，造成谷子幼苗氮素代謝過程紊亂。這種影響具有基因型之間的差異。

(3) 在本實驗條件下，Ni2+脅迫使谷子幼苗體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量下降，脯氨酸含量增加，且脯氨酸對氨毒害具有明顯的緩解作用。

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Effect of Ni on the growth and nitrogen metabolism in foxtail millet seedlings of different genotypes

CUI Xiuxiu, ZHANG Yixian*

CollegeofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China

Nowadays, soil pollution by Ni2+is getting more severe in some place of China. Nickel (Ni) is an essential microelement of plants, however, large Ni2+accumulation in crops leads to necrosis of plant leaf, lignification of stem and growth inhibition of root. The mechanisms of the Ni2+toxicity are not well understood for nitrogen metabolism of higher plants. In this study, pot culture was conducted to investigate the effects of Ni2+on the growth of roots and shoots, biomass, the uptake and accumulation of Ni2+, the contents of nitrate nitrogen, ammonium nitrogen, free proline and soluble proteins, the nitrogen metabolism key enzymatic activities including nitrate reductase (NR), glutamine synthase (GS), glutamate synthase (GOGAT), glutamate dehydrogenase (GDH) in four genotypes (13- 36, B- 7, Jingu 51, Jingu 52) of foxtail millet (Setariaitalica(L.) Beauv) seedlings from Shanxi, China. The foxtail millet seeds were cultured in incubators at 26℃ for germination with no light, then planted in the pots spiked with five different Ni2+concentration, namely 25, 50, 100, 150, 200 (mg/kg). The experimental results showed that with the rise of Ni2+concentration the root length, shoot length and biomass declined and the accumulation of Ni2+increased gradually, which formed a sharp contrast with the control group (P<0.05). In the range of test Ni2+concentration, the content of nitrate nitrogen, the activities of NR, GS, GOGAT of four genotypes of foxtail millet characterized by increasing at low concentration (25—50mg/kg) and declining at high concentration (50—200 mg/kg). The activities of NR, GS, GOGAT reached the peak values when exposed to 50mg/kg Ni2+. The nitrate nitrogen contents and NR activities in 13- 36 were higher than other three genotypes (P<0.05). The activities of GS and GOGAT in 13- 36, B- 7, Jingu51 were 1.69, 1.47, 1.19 and 2.84, 1.03, 3.17 times than those of control group in 50mg/kg Ni2+exposure. However, The GDH activities decreased when the Ni2+concentration higher than 100mg/kg. Ni2+treatments increased the accumulation of ammonium nitrogen in range of 50 to150 mg/kg in the leaves of four foxtail millet and were 1.14 to 3.02 times than control group. Besides these, with the increasing of Ni2+concentration, the content of free proline increased, the soluble protein decreased. Synthesize the above results, we found that Ni2+treatments impaired N assimilation in foxtail millet seedlings by restraining the absorption of nitrate nitrogen and inhibiting the activities of NR, GS and GOGAT, which lead to nitrogen metabolism disturbance. And the toxicity effect was different among different genotypes of foxtail millet. Further, Ni2+stress inhibited the growth of foxtail millet. The tolerance order of four foxtail millets to Ni2+was 13- 36>B- 7>Jingu51>Jingu52.

foxtail millet (Setariaitalica(L) Beauv); Ni stress; growth response; nitrogen metabolism

國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項基金項目(nycytx- 13)；山西省自然科學基金項目(2006011074)

2013- 10- 08;

2014- 11- 17

10.5846/stxb201310082415

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhangyx@sxu.edu.cn

崔秀秀，張義賢.Ni脅迫對不同基因型谷子幼苗生長及氮素代謝的影響.生態(tài)學報,2015,35(10):3244- 3251.

Cui X X, Zhang Y X.Effect of Ni on the growth and nitrogen metabolism in foxtail millet seedlings of different genotypes.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3244- 3251.