呂翠環(huán)，鄭立恒，王 紅，張聰瑤，李玉靜，朱桂云

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗科,河北 石家莊 050041；2.河北省胸科醫(yī)院病理科,河北 石家莊 050041)

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·論 著·

T-SPOT.TB與結(jié)核蛋白芯片檢測在結(jié)核性腦膜炎輔助診斷中的對比分析

呂翠環(huán)1，鄭立恒1，王 紅1，張聰瑤1，李玉靜1，朱桂云2

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗科,河北 石家莊 050041；2.河北省胸科醫(yī)院病理科,河北 石家莊 050041)

目的探討結(jié)核感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點試驗(Tcellsspottestoftuberculosisinfection,T-SPOT.TB)與結(jié)核蛋白芯片檢測在結(jié)核性腦膜炎(tuberculousmeningitis，TBM)中的輔助診斷價值。方法采集TBM患者血標(biāo)本分別進(jìn)行T-SPOT.TB與結(jié)核蛋白芯片檢測,并對2種方法進(jìn)行評價分析。結(jié)果T-SPOT.TB檢測TBM的敏感度和準(zhǔn)確度分別為71.88%、77.97%，高于結(jié)核蛋白芯片檢測的48.78%、60.29%(P<0.05或<0.01)，T-SPOT.TB和結(jié)核蛋白芯片檢測TBM的特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(85.19% vs 77.78%，P>0.05)。結(jié)論在輔助診斷TBM方面T-SPOT.TB檢測方法優(yōu)于結(jié)核蛋白芯片檢測。

結(jié)核,腦膜；酶聯(lián)免疫斑點測定；結(jié)核蛋白芯片檢測doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.030

結(jié)核性腦膜炎(tuberculousmeningitis，TBM)是較常見的肺外結(jié)核病之一，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜、多樣，病情進(jìn)展迅速，診斷和鑒別診斷較為困難，易造成誤診而帶來嚴(yán)重后果[1]。因此，尋找一種無創(chuàng)、快速和準(zhǔn)確的診斷方法是提高TBM診斷水平的關(guān)鍵。當(dāng)前較常用的快速診斷結(jié)核性腦膜炎的方法中涂片鏡檢和聚合酶鏈反應(yīng)敏感度較差,且腦脊液標(biāo)本不易獲取。本研究以TBM患者的血液標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點試驗(Tcellsspottestoftuberculosisinfection,T-SPOT.TB)檢測γ干擾素釋放水平，并與結(jié)核蛋白芯片法檢測比較，探討二者對TBM的診斷價值?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年5月—2014年10月在河北省胸科醫(yī)院臨床確診的TBM患者73例，均符合TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。隨機(jī)分為：T-SPOT.TB組32例，男性18例，女性14例，年齡11～74歲,平均(38.6±18.1)歲；結(jié)核蛋白芯片檢測組41例，男性23例，女性18例，年齡11～77歲，平均(38.1±16.2)歲。所有患者均出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱、頭痛、嘔吐癥狀，腦膜刺激征陽性。另選取非TBM患者27例作為特異度檢測的對照組，男性15例,女性12例，年齡7～78歲，平均(39.5±16.4)歲，其中病毒性腦炎18例,化膿性腦膜炎9例。

1.2 試劑與儀器T-SPOT.TB試劑盒來自英國OxfordImmunotech公司，結(jié)核蛋白芯片試劑盒及PBT-X2型生物識別判讀儀均來自南京大淵生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1T-SPOT.TB檢測 ①外周血單個核細(xì)胞的分離、收集與計數(shù)；②體外抗原刺激與孵育；③結(jié)果判定：陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個，抗原A或抗原B檢測孔計數(shù)-陰性孔計數(shù)≥6判為陽性；如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6，檢測孔斑點數(shù)≥2倍陰性孔斑點數(shù)判為陽性。操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.2 結(jié)核蛋白芯片檢測 由南京大淵生物技術(shù)公司應(yīng)用該公司生產(chǎn)的結(jié)核抗體蛋白檢測系統(tǒng)對血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，根據(jù)系統(tǒng)芯片閱讀儀設(shè)置參數(shù)自動判別檢測結(jié)果。采用本芯片檢測結(jié)核分枝桿菌共有3個指標(biāo)，分別是脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomanan,LAM)、相對分子質(zhì)量16 000蛋白和38 000蛋白，其中任何1個指標(biāo)陽性均計為結(jié)核分枝桿菌抗體陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

TBM組和對照組患者均進(jìn)行T-SPOT.TB和結(jié)核蛋白芯片檢測。若以TBM組T-SPOT.TB和結(jié)核蛋白芯片陽性結(jié)果判為真陽性(a)、陰性結(jié)果判為假陰性(c)，對照組T-SPOT.TB和結(jié)核蛋白芯片陽性結(jié)果判為假陽性(b)、陰性結(jié)果判為真陰性(d)，按照敏感度=a/(a+c)×100%，特異度=d/(b+d)×100%，準(zhǔn)確度=(a+d)/(a+b+c+d)×100%，計算出敏感度、特異度、準(zhǔn)確度。

2種檢測方法中敏感度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.960,P=0.047)，特異度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.491,P=0.480)，準(zhǔn)確度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.573,P=0.003)，見表1。

表1 2種檢測方法的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度 (例數(shù))

3 討 論

隨著相關(guān)結(jié)核感染性疾病診斷技術(shù)的不斷問世，T-SPOT.TB檢測成為診斷肺外結(jié)核病的重要手段，尤其是對TBM[3],T-SPOT.TB已成為目前敏感度較高的細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)[4]。結(jié)核蛋白芯片反應(yīng)是一種體液免疫，是由體內(nèi)B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白,運(yùn)用蛋白芯片技術(shù)聯(lián)合檢測LAM、相對分子質(zhì)量38 000蛋白與16 000蛋白也可提高靈敏度[5]，本研究就2種檢測方法的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度進(jìn)行分析對比。

T-SPOT.TB原理是機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌感染后產(chǎn)生的記憶性T細(xì)胞，在再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激時會釋放γ干擾素，可以在體外對釋放的γ干擾素水平或能有效釋放γ干擾素的T細(xì)胞進(jìn)行定量檢測，從而判斷患者是否為結(jié)核分枝桿菌的感染者。結(jié)核桿菌蛋白芯片檢測原理是以微孔濾膜為載體,利用微數(shù)組技術(shù)將純化的結(jié)核分枝桿菌LAM、基因工程生產(chǎn)并純化的結(jié)核分枝桿菌16 000蛋白和38 000蛋白3種抗原固定在同一膜片上,并利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用,使抗原抗體反應(yīng)在微孔濾膜上快速進(jìn)行,以免疫金為標(biāo)記物在膜上直接顯色,通過芯片識別儀,在專門軟件的支持下對不同抗原點陣的灰度值進(jìn)行分析，實現(xiàn)3種抗原對抗體同步檢測,其中任何1個指標(biāo)陽性均提示結(jié)核分枝桿菌抗體陽性，從而快速對結(jié)核菌感染情況作出診斷。

本研究以化膿性腦膜炎和病毒性腦炎為對照組，對TBM患者血標(biāo)本分別進(jìn)行T-SPOT.TB及結(jié)核蛋白芯片檢測，T-SPOT.TB檢測的敏感度和準(zhǔn)確度高于結(jié)核蛋白芯片檢測(P<0.05或<0.01)，特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。T-SPOT.TB檢測TBM的敏感度不同于曾劍鋒等[6]、韋海旭等[7]的研究， 也低于肺結(jié)核及結(jié)核性胸膜炎等其他結(jié)核性疾病[8-9]。γ干擾素是結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答中最重要的細(xì)胞因子[10]，在大多數(shù)免疫力正常的感染者中，獲得性免疫能夠控制卻不足以清除結(jié)核感染，吞噬了結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞被纖維包裹形成肉芽腫而使感染局限，這時機(jī)體呈現(xiàn)一種無癥狀的隱性感染狀態(tài)，而結(jié)核特異性記憶型T細(xì)胞在機(jī)體中長期存在[11]。機(jī)體再次感染結(jié)核菌后，受抗原刺激，記憶型T細(xì)胞能迅速活化增殖，釋放γ干擾素。本研究TBM較一般結(jié)核患者檢測陽性率低的原因，可能是部分TBM患者早期應(yīng)用激素治療從而影響到細(xì)胞免疫反應(yīng)，且γ干擾素表達(dá)水平與TBM病程有相關(guān)性[12]。

結(jié)核蛋白芯片是一種診斷結(jié)核的重要標(biāo)志物，尤其對結(jié)核菌檢測陰性患者，但其對診斷TMB仍有其局限性[13]。本研究結(jié)果顯示結(jié)核蛋白芯片檢測的敏感度為48.78%(20/41)，低于其他結(jié)核性疾病[14-15]?？赡苁怯捎诜谓Y(jié)核胞外菌體脫落復(fù)制直接刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[16]，另外在結(jié)核患者不同患病時間內(nèi)體內(nèi)抗體水平也不相同，故檢測得出的敏感度也不相同。

T-SPOT.TB檢測作為檢測TBM的酶免疫學(xué)方法，敏感度、準(zhǔn)確度較高，但檢測價格昂貴，檢測時間較長；而結(jié)核蛋白芯片檢測方法簡便、快速。對于臨床癥狀不典型、抗酸桿菌檢測陰性的TBM病例，如果條件允許，二者聯(lián)合檢測是更有意義的診斷輔助手段。

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(本文編輯：趙麗潔)

2015-08-24；

2015-10-26

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃(13277794D)；河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃(132777269)

呂翠環(huán)(1966-),女,河北石家莊人,河北省胸科醫(yī)院主任技師,醫(yī)學(xué)學(xué)士,從事臨床檢驗學(xué)研究。

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1007-3205(2015)11-1345-03