楊學(xué)麗，路三軍，魏 娉，桂紅武，安 欣，姜琳娜，尹 峰

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌中的表達(dá)及臨床意義

楊學(xué)麗，路三軍，魏 娉，桂紅武，安 欣，姜琳娜，尹 峰

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

目的 探討GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)S-P方法分別檢測(cè)79例患者近端胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織的GSK-3β、DKK-1、β-catenin表達(dá)情況，并分析其臨床意義。結(jié)果 GSK-3β在近端胃癌組織的表達(dá)比癌旁組織及正常胃黏膜組織表達(dá)量明顯降低(P均<0.05)，GSK-3β陽性表達(dá)率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P均<0.05)。DKK-1在近端胃癌的表達(dá)比癌旁組織及正常胃黏膜的表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)，DKK-1 陽性表達(dá)率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤(rùn)程度顯著相關(guān)(P均<0.05)。β-catenin在近端胃癌中細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的異常表達(dá)比癌旁組織及正常胃黏膜的異常表達(dá)均明顯升高(P均<0.05)。GSK-3β的表達(dá)與DKK-1的表達(dá)及β-catenin的異常表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，可作為近端胃癌診斷和判斷預(yù)后的指標(biāo)。

近端胃癌;GSK-3β;DKK-1;β-catenin

胃癌(gastric carcinoma，GC)是我國(guó)乃至世界最常見的惡性腫瘤之一，因其侵襲性強(qiáng)和易于轉(zhuǎn)移而位居癌癥致死原因的前列[1]。近年來研究表明，近端胃癌與其他部位胃癌無論是發(fā)病人群、手術(shù)方式、預(yù)后等均有不同，已知幽門螺桿菌誘導(dǎo)性胃炎所致的胃酸下降可導(dǎo)致遠(yuǎn)端胃癌的發(fā)生[2]，而近端胃癌發(fā)病機(jī)制尚不明確。DKK-1(Dickkopf-1)、糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、β-catenin均是參與Wnt 腫瘤信號(hào)通路的重要成分，本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定三者在不同部位胃癌組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理因素，分析它們?cè)诮宋赴┌l(fā)生發(fā)展中的作用。

1 研究資料

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 取自邯鄲市第一醫(yī)院病理科2013—2014年提供的近端胃癌標(biāo)本79例，同時(shí)收集胃癌組織、癌旁組織(距腫物2 cm) 和正常胃黏膜組織(距腫物5 cm以上)，經(jīng)10%福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、切片并經(jīng)2名資深病理科醫(yī)生確診。患者參照WHO 推薦的分級(jí)分化標(biāo)準(zhǔn)，高分化腺癌9例，中分化鱗癌59例，低分化腺癌11例。其中男62例，女17例；年齡18～85(56.4±5.3歲)。每例均有詳細(xì)的臨床資料，術(shù)前均未進(jìn)行化療及放療。所有患者的標(biāo)本采集符合倫理學(xué)規(guī)定并得到認(rèn)可，且患者簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 兔抗人GSK-3β( BS1402) 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology 公司，兔抗人DKK-1 多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 生物技術(shù)公司，兔抗人β-catenin 多克隆抗體、S-P免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB 顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司，光學(xué)顯微鏡和Olympus DP70 圖像采集系統(tǒng)來自日本Olympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟 取近端胃癌組織的石蠟包埋標(biāo)本，制成4 μm 厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，微波修復(fù)抗原，3%過氧化氫溶液以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。正常山羊血清封閉，分別滴加一抗為兔抗人GSK-3β( BS1402) 多克隆抗體、兔抗人DKK-1 多克隆抗體(1∶100)和兔抗人β-catenin多克隆抗體(1∶100)，37 ℃孵育2～3 h后依次滴加山羊抗兔二抗，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素。DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固。以上實(shí)驗(yàn)以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)染色細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)分。在高倍光鏡下(×200) 挑選5 個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。①GSK-3β 陽性信號(hào)主要定位在細(xì)胞質(zhì)，染色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為不表達(dá)或<30%細(xì)胞表達(dá)為0分，陽性細(xì)胞數(shù)30%～50%為1分，陽性細(xì)胞數(shù)51%～70%為2分，陽性細(xì)胞數(shù)>70%為3分。0～1分視為陰性，2～3分為陽性。②DKK-1主要在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核表達(dá)，根據(jù)染色程度評(píng)分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將細(xì)胞染色程度計(jì)分與陽性百分?jǐn)?shù)計(jì)分相加即為綜合評(píng)分，積分為0～2分表示陰性(-)，3～4分為陽性(+)，5～6分為強(qiáng)陽性()，后兩者均視為陽性表達(dá)。③β-catenin染色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞膜表達(dá)減少或基本消失為0分，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核表達(dá)為1分，異質(zhì)性表達(dá)減弱為2分，保留細(xì)胞膜的表達(dá)為3分。0～2分為異常表達(dá)，3分為正常表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn)，并將3個(gè)不同指標(biāo)行Speraman相關(guān)分析，α=0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況 在近端胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜組織中均有GSK-3β、DKK-1、β-catenin的表達(dá)。GSK-3β主要位于細(xì)胞質(zhì)(見圖1)，近端胃癌組織比癌旁組織及正常胃黏膜組織表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)；DKK-1在近端胃癌、癌旁組織和正常胃黏膜中均有表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)(見圖2)，近端胃癌比癌旁組織及正常胃黏膜的表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)。β-catenin在近端胃癌、癌旁組織和正常胃黏膜中均有細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的異常表達(dá)(見圖3)，近端胃癌比癌旁組織及正常胃黏膜的異常表達(dá)均明顯升高(P均<0.05)。各指標(biāo)具體表達(dá)情況見表1。

圖1 GSK-3β在近端胃癌組織中的表達(dá)(SP法，×400)

圖2 DKK-1在近端胃癌組織中的表達(dá)(SP法，×400)

圖3 β-catenin在近端胃癌組織中的異常表達(dá)(SP法，×400)

表1 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá) 例(%)

2.2 GSK-3β、DKK-1與近端胃癌組織臨床病理特征的關(guān)系 GSK-3β陽性表達(dá)率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡無明顯相關(guān)性(P均>0.05)；DKK-1 陽性表達(dá)率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤(rùn)程度顯著相關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。見表2。

表2 GSK-3β、DKK-1達(dá)與近端胃癌組織臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 GSK-3β、DKK-1、β-catenin在近端胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 在79例近端胃癌中，GSK-3β與DKK-1的陽性表達(dá)與β-catenin的異常表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.545，P<0.05)。

3 討 論

在當(dāng)今的醫(yī)療檢查設(shè)備條件下, 近端胃癌被發(fā)現(xiàn)時(shí)通常正處于進(jìn)展期，而且由于解剖部位的特殊性，近端胃癌患者的腫瘤還時(shí)常浸潤(rùn)組織,造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致近端胃癌患者治療困難，預(yù)后差。WHO把其歸類于食管胃交界腺癌，指腫瘤完全位于食管胃交界下方，未侵及食管。

分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化以及遷移等方面起著重要的調(diào)控作用，β-catenin與GSK-3β是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的2個(gè)重要調(diào)節(jié)因子[3]。GSK-3β是這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的調(diào)節(jié)分子，它與APC和Axin 形成復(fù)合體，使β-catenin N 端絲氨酸/蘇氨酸磷酸化引起β-catenin 降解，從而調(diào)節(jié)β-catenin的細(xì)胞內(nèi)含量、定位和功能[4]。本研究結(jié)果顯示，GSK-3β在近端胃癌組織中的表達(dá)比癌旁組織及正常胃黏膜組織表達(dá)量明顯降低，并與β-catenin的異常表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，表明GSK-3β的低表達(dá)可能促進(jìn)近端胃癌細(xì)胞的增殖，與其發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)，GSK-3β陽性表達(dá)率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示GSK-3β與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致。

DKK-1 是一種分泌型糖蛋白，屬于DKK家族成員，是一種有力的Wnt信號(hào)途徑拮抗劑。DKK-1 通過誘導(dǎo)形成一種三元復(fù)合物產(chǎn)生內(nèi)吞作用，發(fā)揮抑制功能，造成Wnt 經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑阻斷，從而誘導(dǎo)體內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[6-7]。本研究結(jié)果顯示，DKK-1在近端胃癌中的表達(dá)比癌旁組織及正常胃黏膜的表達(dá)量明顯升高，與本研究組前期研究結(jié)果一致[8]；同時(shí)研究顯示，DKK-1 陽性表達(dá)率與TNM分期、分化程度、肌層浸潤(rùn)程度顯著相關(guān)。多種腫瘤中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被抑制是由于APC 或者β-catenin 改變而引起DKK-1 在人類細(xì)胞中的表達(dá)[9]，由此構(gòu)成了一個(gè)負(fù)反饋回路，這可能是胃癌中DKK-1 表達(dá)增加的原因。Lee等[10]對(duì)胃癌患者組織及血清DKK-1表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組血清DKK-1濃度明顯高于健康對(duì)照組，腫瘤組織中DKK-1高表達(dá)與血清DKK-1高濃度具有相關(guān)性，本研究結(jié)果與其一致。然而有研究認(rèn)為胃癌組織中DKK-1的表達(dá)下調(diào)[11]。故DKK-1在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌發(fā)生的部位是否具有相關(guān)性尚需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，在正常胃組織和癌旁組織中，β-catenin均呈膜表達(dá)，而在近端胃癌組織中β-catenin呈胞漿及胞核表達(dá)，并與DKK-1的表達(dá)呈正相關(guān)，與GSK-3β的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示三者在近端胃癌的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，可作為近端胃癌的診斷和判斷預(yù)后的指標(biāo)。然而腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段改變的復(fù)雜過程，該途徑中多種因子變化的機(jī)制尚不完全明確，還需要進(jìn)一步研究。

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Expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin in proximal gastric cancer and their clinical significance

YANG Xueli, LU Sanjun, WEI Ping, GUI Hongwu, AN Xin, JIANG Linna, YIN Feng

(The First Hospital of Handan City, Handan 056002, Hebei, China)

Objective It is to investigate the expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin in proximal gastric cancer and their clinical significance. Methods The expression of GSK-3β, DKK-1 and β-catenin were detected in pathological tissue sections of proximal gastric cancer tissues, para-neoplastic tissues and normal gastric mucosa from 79 patients with gtastric cancer by immunohistochemical SP method. Their clinical pathological features were analyzed statistically. Results The expression of GSK-3β in the proximal gastric cancer were significantly lower than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The positive expression rates of GSK-3β were related with tissue differentiation, TNM clinical stage, myometrial invasion and lymph node metastasis (allP<0.05). The expression of DKK-1 in the proximal gastric cancer were significantly higher than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The positive expression rates of DKK-1 were related with tissue differentiation, TNM clinical stage, myometrial invasion (allP<0.05). The abnormal expression of β-catenin in the para-carcinoma tissues were significantly higher than that in the para-neoplastic tissues and the normal gastric mucosa (allP<0.05). The expression of GSK-3β has significantly negative correlation with the expression of DKK-1 and the abnormal expression of β-catenin (allP<0.05). Conclusion GSK-3β, DKK-1 and β-catenin play an important role in the development, invasion and metastasis of proximal gastric cancer. They can be used as an index of diagnosis and prognosis of proximal gastric cancer.

proximal gastric cancer; GSK-3β; dickkopf-1; β-catenin

楊學(xué)麗，女，碩士研究生，主治醫(yī)師，從事胃腸道疾病病理診斷工作。

路三軍，E-mail:lusanjun211@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.24.008

R735.2

A

1008-8849(2015)24-2646-04

2015-02-10