楊丹王麗李珠劉趙陽孫燕郭麗付佳祁榮王俊平

·論 著·

胡桃醌對膠質(zhì)瘤細胞株U-87 MG遷移、侵襲能力的抑制作用☆

楊丹*王麗*李珠*劉趙陽*孫燕*郭麗**付佳**祁榮**王俊平*

目的探討肽基脯酰胺順反異構酶Pin1（peptidyl-prolyl isomerase 1）抑制劑胡桃醌（Juglone）對膠質(zhì)瘤細胞U-87 MG遷移、侵襲能力的影響并探討相關機制。方法膠質(zhì)瘤細胞株U-87 MG經(jīng)0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌處理后，以細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力，transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力，western blot法檢測β-鏈蛋白（β-catenin）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的蛋白表達水平。結(jié)果細胞劃痕實驗結(jié)果顯示1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌組U-87 MG細胞劃痕創(chuàng)面愈合率分別為46.04%±6.25%和30.05%±13.35%，與0 μmol·L-1組比較明顯下降（P＜0.05）；transwell小室實驗結(jié)果顯示1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌組穿膜細胞數(shù)平均為（103.67±5.69）個和（77.33±7.77）個，與0 μmol·L-1組比較明顯減少（P＜0.05）；western blot實驗結(jié)果顯示胡桃醌可顯著下調(diào)U-87 MG細胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平，作用隨濃度增加而增大。結(jié)論胡桃醌可通過下調(diào)β-catenin及其下游MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表達而抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲能力。

胡桃醌 膠質(zhì)瘤 β-鏈蛋白 血管內(nèi)皮細胞生長因子 基質(zhì)金屬蛋白酶-2基質(zhì)金屬蛋白酶-9

胡桃醌（Juglone）屬于萘醌類，分子量174.16，是肽基脯酰胺順反異構酶Pin1（peptidyl-prolyl isomerase 1）的小分子抑制劑。目前研究表明胡桃醌具有顯著的抗腫瘤作用，但研究多為觀察其對瘤細胞增殖和凋亡的影響，關于其對腫瘤遷移、侵襲能力影響的報道較少見[1,2]。本研究擬采用細胞劃痕實驗和Transwell小室法檢測其對膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲能力的抑制作用，同時檢測胞內(nèi)β-鏈蛋白（β-catenin）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（vas?cular endothelial growth factor,VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白含量的變化，從分子水平探討胡桃醌抑制人膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲能力的機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象人膠質(zhì)瘤U-87 MG細胞株由中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫提供，將細胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，用DMEM高糖培養(yǎng)基+10%FBS培養(yǎng)（加入1%L-谷氨酰胺，1%青鏈霉素），1～2 d更換培養(yǎng)液1次,每2～3 d傳代一次，實驗時選用對數(shù)生長期細胞。試劑與儀器：胡桃醌和溴化四氮唑藍（MTT）（Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基及胰酶（Gibco公司）；新生牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；化學發(fā)光檢測試劑盒（Pierce公司）；Matrigel（BD公司）；Transwell小室（Costar公司）；VEGF、MM P-2、MMP-9抗體（Santa Cruz公司）；β-catenin抗體（CST公司）；PVDF膜（Millipore公司）。

1.2 MTT比色法檢測細胞增殖將U-87 MG細胞接種于96孔板中，細胞濃度為5×104mL-1細胞，體積為100 μL，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。加入胡桃醌培養(yǎng)液（終濃度分別為0、15.63、31.25、62.5、125和250 μmol·L-1）體外培養(yǎng)48h后，每孔加入20 μL MTT（終濃度5 g·L-1），37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μLDMSO振蕩10 min，于490 nm測定吸光度值。

1.3 細胞劃痕實驗將U-87 MG細胞接種于6孔板中，待細胞生長至90%融合后用200 μL吸頭在6孔板內(nèi)垂直劃痕，用PBS清洗細胞3次后加入無血清培養(yǎng)基及終濃度0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌繼續(xù)培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下拍照記錄。

1.4 Transwell小室侵襲實驗參照文獻記述的方法[3]，加入終濃度0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌繼續(xù)24 h后，每個小室取5個視野計穿膜細胞個數(shù)，以穿膜細胞的數(shù)目表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達分別以0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌刺激細胞24 h后，收集細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到NC膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液常溫封閉1 h，加入一抗，4℃反應過夜，再用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下反應0.5 h，化學發(fā)光法顯影；利用Image J軟件對目的條帶進行灰度值檢測，以actin為內(nèi)參照分析蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗。檢測水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胡桃醌對U-87 MG細胞增殖抑制作用胡桃醌處理U-87 MG細胞48 h后采用MTT法檢測各組吸光度，計算胡桃醌對U-87 MG細胞的增殖抑制率。如圖1所示，與0 μmol·L-1組比較，15.63、31.25、62.5、125和250 μmol·L-1胡桃醌組U-87 MG細胞生存率明顯降低，細胞增殖抑制率隨濃度升高明顯增加，分別為7.46%±2.96%、24.95%± 3.33%、39.90%±2.67%、57.44%±1.89%和99.49%±

0.81%，提示當胡桃醌濃度低于15.6μmol·L-1時其對U-87 MG細胞的增殖抑制作用弱，隨著胡桃醌濃度增加，其對U-87 MG細胞的增殖抑制作用逐漸增高。胡桃醌作用48 h的IC50值為（78.45± 12.99）μmol·L-1。

2.2 胡桃醌可抑制U-87 MG細胞的遷移能力 選取胡桃醌作用48 h的IC50值的1/25為考察其對U-87 MG細胞的遷移能力影響作用的最大濃度值，此濃度下胡桃醌作用48 h不會對U-87 MG細胞增殖產(chǎn)生影響。劃痕實驗后分別于0 h和48 h時在倒置光學顯微鏡下觀察并測量劃痕傷口的寬度進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果如圖2和表1所示：劃痕后48 h，各組創(chuàng)面愈合率隨胡桃醌濃度增加逐漸降低，0 μmol·L-1組為92.91%±1.41%、0.8 μmol· L-1組為87.46%±6.14%、1.6 μmol·L-1組為46.04%± 6.25%、3.2 μmol·L-1組為30.05%±13.35%。 與0 μmol·L-1組相比，1.6μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌組U-87 MG細胞的創(chuàng)面愈合率明顯下降（F= 44.53，P＜0.05），表明U-87 MG細胞的遷移能力隨著胡桃醌濃度的增高而降低。

2.3 胡桃醌可抑制U-87 MG細胞的侵襲能力采用Transwell小室法檢測胡桃醌對U-87 MG細胞侵襲能力的影響，結(jié)果如圖2和表1所示：加入0、 0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌組中穿過基膜的細胞數(shù)分別為（204.67±6.11）個、（192.00±12.17）個、（103.67±5.69）個和（77.33±7.77）個。與0 μmol·L-1組相比1.6 μml·L-1和3.2 μml·L-1胡桃醌組小室濾膜下表面的細胞個數(shù)明顯減少（F=173.45，P＜0.05），表明U-87 MG細胞的侵襲能力隨著胡桃醌濃度的增高而降低。

2.4 胡桃醌抑制U-87 MG細胞中β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9的蛋白表達胡桃醌處理U-87 MG細胞后，western blot法檢測細胞內(nèi)β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達的變化。結(jié)果如圖3和表2所示：給予U-87 MG細胞0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌作用24 h后，與0 μmol·L-1組相比，1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌組細胞內(nèi)β-catenin（F=17.24）、VEGF（F= 33.76）、MMP-2（F=10.907）和MMP-9（F=354.79），的蛋白表達都明顯降低（P＜0.05），并且具有濃度依賴性。

表1 胡桃醌對U-87 MG細胞的遷移、侵襲能力的影響

表2 胡桃醌對膠質(zhì)瘤U-87 MG細胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白相對表達的影響（±s，n=5）

表2 胡桃醌對膠質(zhì)瘤U-87 MG細胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白相對表達的影響（±s，n=5）

1)與0μmol·L-1組比較，單因素方差分析，P＜0.05

胡桃醌（μmol·L-1）0 0.8 1.6 3.2 n 5 5 5 5 β-catenin 0.68±0.03 0.61±0.201)0.46±0.281)0.22±0.131)VEGF 0.73±0.42 0.47±0.15 0.44±0.171)0.31±0.091)MMP-2 0.70±0.34 0.56±0.09 0.53±0.061)0.32±0.011)MMP-9 1.79±0.13 1.71±0.07 0.50±0.131)0.28±0.071)

圖2 Transwell侵襲實驗和劃痕實驗分別檢測各組細胞侵襲能力（×100）和遷移能力（×40）

圖3 western blot法檢測加入胡桃醌24 h后細胞內(nèi)β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

3 討論

胡桃醌存在于胡桃科植物的所有部分，在我國胡桃科植物資源豐富，因此胡桃醌作為抗腫瘤活性單體具有較大的開發(fā)潛力[4]。

膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲是膠質(zhì)瘤復發(fā)以及治療失敗的重要原因。Pin1在膠質(zhì)瘤的過量表達與腫瘤高轉(zhuǎn)移性有著密不可分的聯(lián)系。胡桃醌是Pin1的小分子抑制劑，本研究通過transwell侵襲實驗和劃痕實驗檢測胡桃醌對膠質(zhì)瘤U-87 MG細胞遷移、侵襲能力的影響，結(jié)果顯示較低濃度（1.6 μmol·L-1）胡桃醌即可明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲能力，并且由于此濃度遠低于其產(chǎn)生較明顯抑制細胞增殖的濃度（15.63 μmol·L-1），證明其對細胞遷移和侵襲能力的抑制率高于生長抑制率，說明大量細胞在死亡之前就已經(jīng)喪失遷移、侵襲能力，因此胡桃醌在膠質(zhì)瘤惡性侵襲方面可能發(fā)揮有效的治療作用。

Pin1活性與Wnt信號途徑中的關鍵因子β-catenin功能有關，Pin1可上調(diào)細胞中β-catenin蛋白的水平并促進其活性。β-catenin異常表達及活化可以導致腫瘤細胞的遷移、侵襲性增強[5]，故為了進一步探討胡桃醌抑制膠質(zhì)瘤遷移、侵襲作用的分子機制，本研究選擇β-catenin為研究的切入點。本研究中western blot實驗結(jié)果顯示，胡桃醌能顯著降低膠質(zhì)瘤U-87 MG細胞β-catenin蛋白表達，說明胡桃醌抑制細胞的遷移和侵襲作用可能與其抑制Wnt/β-catenin信號傳導通路活性有關。

Wnt/β-catenin信號傳導通路可通過激活多種下游分子促進腫瘤細胞遷移、侵襲，如MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白。MMP-2、MMP-9是人體內(nèi)分布最廣泛的基質(zhì)金屬蛋白酶，體外研究顯示抑制MMP-2、MMP-9的活性可以阻滯膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲[6,7]。VEGF具有通過活化多種蛋白酶降解周圍基質(zhì)而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。已有多項研究表明Wnt/β-catenin信號通路活化可提高MMP-2、MMP-9和VEGF表達[8-9]。為進一步研究

胡桃醌對Wnt/β-catenin信號傳導通路活性的抑制作用與其抑制細胞的遷移和侵襲作用相關性，本研究以western blot法檢測胡桃醌對Wnt/β-catenin信號傳導通路下游與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移關系密切的MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達水平的影響，研究結(jié)果顯示胡桃醌能顯著降低膠質(zhì)瘤U-87 MG細胞MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達水平，提示胡桃醌抑制細胞的遷移和侵襲作用可能與其抑制Wnt/β-catenin信號傳導通路活性進而下調(diào)其下游MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表達有關。

綜上，本研究表明胡桃醌可抑制膠質(zhì)瘤細胞株U-87 MG遷移、侵襲能力，其作用機制與通過抑制Wnt/β-catenin信號傳導通路活性進而下調(diào)其下游腫瘤細胞遷移、侵襲相關的重要調(diào)節(jié)因子MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表達相關。

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Inhibitory effect of juglone on migration and invasion of glioma cell line U-87 MG.

YANG Dan，WANG Li，LIZhu，LIU Zhaoyang，SUN Yan，GUO Li，F(xiàn)U Jia，QI Rong，WANG Junping.Department of Pharmacology,Shenyang Medi?cal College,No.146,North Huanghe Street,Huanggu District,Shenyang 110034,China.Tel：024-62215689.

ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of pin1(peptidyl-prolyl isomerase 1)inhibitor ju?glone on migration and invasion in glioma cell line U-87 MG.MethodsGlioma cells were treated with juglone at 0,0.8, 1.6 and 3.2 μmol·L-1.Wound-healing assay and invasion assay were performed to examine the inhibitory activity of ju?glone on glioma cell line U-87 MG.Western blot was used to analyze the protein expression of β-catenin,VEGF, MMP-2 and MMP-9.ResultsThe wound-healing assay showed that the wound-healing rate in juglone-treated groups was 46.04%±6.25%and 30.05%±13.35%at concentrations of 1.6 μmol·L-1and 3.2 μmol·L-1,repectively.Juglone treat?ment significantly reduced the wound-healing rate compared with controls(P＜0.05).Transwell invasion assay showed that the number of invaded cells in juglone-treated groups was 103.67±5.69 and 77.33±7.77 at the concentrations of 1.6 μmol·L-1and 3.2 μmol·L-1,respectively.Juglone treatment significantly reduced cell invasion compared with con?trols(P＜0.05).Treatment with juglone significantly down-regulated the expression levels of β-catenin,VEGF,MMP-2 and MMP-9 in U-87 MG cells in a dose-dependent manner.ConclusionThe present data suggests that juglone has a

Juglone Glioma β-catenin VEGF MMP-2 MMP-9

R979.1

A

2015-01-14）

（責任編輯:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.04.010

☆ 沈陽市科技計劃項目（編號：F10-191-8-00）

* 沈陽醫(yī)學院藥理學教研室（沈陽 110034）

** 沈陽醫(yī)學院科學實驗中心

significant inhibitory action on cell migration and invasion through down-regulation of the β-catenin and its downstream VEGF,MMP-2 and MMP-9 protein expressions in glioma cell line U-87 MG.