田永祥, 楊克禮, 段正贏, 周丹娜, 郭 銳, 劉澤文, 袁芳艷, 孟 麗

(湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064)

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高致病性PRRSV濃縮滅活疫苗的研制及免疫效果

田永祥, 楊克禮*, 段正贏, 周丹娜, 郭 銳, 劉澤文, 袁芳艷, 孟 麗

(湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064)

[目的]研制高致病性PRRSV濃縮滅活疫苗。[方法]分別以病毒液、病毒濃縮液作為抗原，以甲醛、β-丙內酯為滅活劑，制成A、B、 C、D 4種滅活疫苗，進行物理性狀和無菌檢驗，安全檢驗合格后，與商品疫苗E進行免疫效果比較。[結果]4種疫苗均有良好的安全性。免疫后35 d，未濃縮抗原的A、C疫苗及商品疫苗E組抗體均未陽轉，濃縮抗原的B、D疫苗組抗體陽轉率分別達到80%和100%。[結論]濃縮病毒液制成的滅活疫苗比未濃縮病毒液制成的滅活疫苗及商品疫苗具有較好的免疫效果。

高致病性PRRSV；濃縮；滅活疫苗；免疫效果

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的豬的具有高度傳染性的病毒性疾病。任何年齡的豬均會被該病毒感染，其臨床表現(xiàn)主要為：懷孕母豬感染后出現(xiàn)流產、早產和死胎等綜合繁殖障礙性疾病，仔豬和育肥豬感染后則多出現(xiàn)呼吸道綜合癥狀[1-3]。1987年，該病毒引起的疾病首次發(fā)現(xiàn)于美國，隨后幾年迅速在美洲、歐洲及亞洲的許多國家廣泛流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]。我國最早于1995年底發(fā)現(xiàn)此病，隨后的2年內先后有研究人員分離到此病毒[5-6]，目前PRRSV仍然在我國很多省(市)的豬群內流行，是嚴重影響規(guī)?；B(yǎng)豬場健康可持續(xù)發(fā)展的主要疫病之一[7]。2006年，我國南方一些省份豬場暴發(fā)的高致病性豬藍耳病傳播迅速，在短短的半年內幾乎傳遍了大半個中國，特別是在養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達的省份造成了巨大的經(jīng)濟損失[8-11]。

對豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的預防，目前大多采用免疫注射的方法，臨床上常用的疫苗主要有2種：弱毒苗和滅活苗。弱毒苗注入豬體內的效果與感染野毒基本相同，只是病毒無致病性，能夠誘導較強的有效免疫力，但弱毒苗接種體內后疫苗毒會在體內增殖，因此接種弱毒苗的豬有可能將疫苗病毒排出傳遞給尚未接種疫苗的豬，或者可能出現(xiàn)弱毒返強而引發(fā)疾病。滅活苗的安全性大大高于弱毒苗，并且不存在散毒的危險，但滅活苗誘導有效免疫力的能力較差。此外，PRRSV有抗體依賴增強作用的特點，低水平的抗體可能是誘發(fā)該病的原因之一。因此，研究能產生有效水平抗體的高效滅活疫苗具有現(xiàn)實意義。為了獲得能夠產生有效保護力的豬高致病性PRRSV疫苗，筆者在對高致病性PRRSV進行流行病學調查和病原分離與鑒定的基礎上，進行了PRRSV濃縮滅活疫苗的研制，并研究了其疫苗免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1疫苗用毒株。PRRSV EZ株，由動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室分離、鑒定與保存。

1.1.2滅活疫苗。試制苗是采用EZ株Marc145細胞培養(yǎng)濃縮物，經(jīng)滅活后加入油佐劑乳化而成。對照苗為購買的商品滅活苗。

1.1.3試驗動物。30～45日齡PRRS抗體陰性仔豬100頭，購自湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所試驗豬場。

1.1.4試劑。PRRS抗體檢測試劑盒，為IDEXX公司產品，購自北京愛德士元亨生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1疫苗制備。將制苗毒株接種已長成單層的Marc145細胞，按照5%的劑量接種病毒液，37 ℃條件下吸附1 h后，加入維持液，置于37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞病變達70%以上時收獲，置于-20 ℃條件下凍融2次，取樣測定毒價。將已凍融2次的病毒收集液以40 000 r/min離心3 h，用TEN洗滌沉淀(體積為收集液的1/10，即濃縮10倍)。將病毒液和濃縮病毒液按以下分組進行滅活：A、B組分別將病毒液、病毒濃縮液按終濃度為0.1%的比例加入甲醛溶液，混勻，置于37 ℃條件下滅活18 h取出，置于2～8 ℃條件下保存。C、D組分別將病毒液、病毒濃縮液按終濃度為0.1%的比例加入β-丙內酯，混勻，置于37 ℃條件下滅活2 h取出，置于2～8 ℃下保存。

分別取上述檢驗合格的滅活病毒懸液96份，加入4份滅菌吐溫-80，攪拌均勻制成水相。取10#白油94份，加入6份司本-80，硬脂酸鋁2份，加熱攪拌溶化后116 ℃下滅菌30 min，制成油相。水相與油相按1∶1.5的比例分別制成4種油佐劑滅活苗，即A苗(甲醛滅活未濃縮病毒苗)、B苗(甲醛滅活濃縮病毒苗)、C苗(β-丙內酯滅活未濃縮病毒苗)、D苗(β-丙內酯滅活濃縮病毒苗)。

1.2.24種疫苗的物理性狀檢驗。按照《中華人民共和國獸藥典》3部2010年版中的方法，分別對4種滅活疫苗的進行劑型、穩(wěn)定性等物理性狀檢驗。

1.2.34種疫苗的無菌檢驗。按照《中華人民共和國獸藥典》3部2010年版中的方法，分別對4種滅活疫苗進行細菌、霉菌、支原體的檢測。

1.2.44種疫苗的安全性檢驗。4種滅活疫苗分別接種18～20 g小鼠10只，皮下注射0.2 ml/只，觀察14 d，小鼠全部健活為合格。

1.2.54種疫苗的免疫效果試驗。將PRRS抗體檢測為陰性的30～45日齡仔豬100頭隨機分成5組，每組20頭，分別肌肉注射A、B、C、D自制滅活疫苗和市售商品滅活疫苗(E苗)2 ml。分別于注射疫苗3、4、5周時靜脈采血分離血清，檢測PRRS抗體。

1.2.6抗體檢測方法。采用IDEXX公司PRRS抗體檢測試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。試驗結果有效的條件為：陽性對照PRRSV孔OD值-陰性對照PRRSV孔OD值≥0.15，陽性對照NHC孔OD值≤0.12，陰性對照NHC孔OD值≤0.25。PRRSV抗體的結果判定標準為：當S/P值≥0.4時，被檢樣品為陽性；當S/P值<0.4時，被檢樣品為陰性。

2 結果與分析

2.1 4種疫苗的物理性狀檢驗按照現(xiàn)行獸藥典的方法進行檢驗，4種滅活疫苗均為混懸液，混合均勻，無分層現(xiàn)象，達到油乳劑滅活疫苗標準。

2.2 4種疫苗的無菌檢驗結果按照現(xiàn)行獸藥典的方法進行檢驗，發(fā)現(xiàn)4種滅活疫苗均無細菌、霉菌及支原體生長，無菌檢驗合格。

2.3 4種疫苗的安全性檢驗結果4種疫苗所接種的18～20 g小鼠10只，于接種后連續(xù)觀察14 d，均全部健活，存活率為100%，安全檢驗合格。

2.4 免疫后抗體檢測結果抗體檢測結果表現(xiàn)，注射疫苗3～5周后，用甲醛或β-丙內酯滅活未濃縮病毒液自制的A苗、C苗組及商品苗E苗組抗體均未陽轉；用甲醛或β-丙內酯滅活病毒濃縮液自制的B苗、D苗組抗體陽轉率分別為20%、40%、80%和40%、60%、100%(表1)。

表1 免疫后仔豬PRRS抗體的檢測結果

3 討論

該試驗結果表明，濃縮病毒液制成的滅活疫苗比未濃縮病毒液制成的滅活疫苗及商品疫苗具有較好的免疫效果，能夠在免疫后相同時間內產生抗體，有利于臨床上該病的免疫預防。該疫苗系用從湖北省分離的豬繁殖與呼吸綜合征高致病性病毒制成的油乳劑滅活苗,針對性強、產毒穩(wěn)定、免疫原性良好。因此，用該病毒作為抗原制備疫苗對控制高致病性PRRSV以及減輕目前該病對湖北省部分豬群造成的危害意義重大。

該研究中筆者觀察到疫苗免疫后出現(xiàn)陽性抗體的時間較長，符合油佐劑滅活疫苗特點。未濃縮抗原疫苗及商品疫苗在免疫后35 d仍未出現(xiàn)能檢測到的PRRS陽性抗體,而濃縮抗原疫苗在免疫后21 d部分豬出現(xiàn)能檢測到的PRRS陽性抗體,28 d左右半數(shù)或接近半數(shù)抗體陽轉，抗體陽轉高峰出現(xiàn)在免疫后5周，初步表明PRRSV滅活疫苗的免疫效果與抗原濃度有直接的關系。

免疫后3～5周，用β-丙內酯滅活的D苗比用甲醛滅活的B苗抗體陽轉數(shù)高，說明PRRSV滅活苗用β-丙內酯作病毒抗原滅活劑效果較好。

該研究中濃縮滅活苗免疫后抗體陽轉高峰出現(xiàn)時間與Yoon等[12]報道基本一致，而與以前國內報道的用PRRS油乳劑滅活疫苗免疫后20 d左右達到抗體高峰有一定差異[13-14]。是否與抗原差異、檢測方法及試劑盒有關，則有待進一步研究。

筆者制備的PRRSV濃縮滅活疫苗,沒有弱毒苗殘余毒力或毒力返強導致PRRS暴發(fā)流行的危險，并便于運輸和保存,并且具有對母源抗體無干擾作用的優(yōu)點，適于國內受高致病性PRRSV威脅的豬群使用。

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Development and Efficacy of Concentrated Inactivated Vaccines against Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

TIAN Yong-xiang, YANG Ke-li*, DUAN Zheng-ying et al (Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding, Wuhan, Hubei 430064)

[Objective] The research aimed to develop vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome. [Method] Using virus and concentrated virus as antigen, and using formaldehyde and β-propiolactone as inactivator, four inactivated vaccines against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome were prepared respectively. After the physical behavior, steriling test, and the safety test, the immunity effect of these four kinds of vaccines and one commercial vaccine were compared. [Result] These four kinds of vaccine all had good safety. After immunization 5 weeks, the specific antibody titers produced by concentrated inactivated vaccines B and D were 80% and 100% respectively, while no specific antibody titers produced by the unconcentrated inactivated vaccines A, C and the commercial vaccine E. [Conclusion] The immune effect of inactivated vaccines prepared with concentrated virus was better than those prepared with unconcentrated virus and the commercial vaccine in this study.

Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome; Concentrated; Inactivated vaccines; Immune effect

湖北省農業(yè)科技創(chuàng)新中心項目(2011-620-001-003)；湖北省重點自然科學基金(2012FFA067)；湖北省重點新產品新工藝研究開發(fā)項目(2012BBA15004)；動物胚胎及分子育種湖北省重點實驗室開放課題(2013ZD156)。

田永祥(1965-)，男，湖北武漢人，研究員，從事動物疾病防控研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事動物傳染病研究。

2015-04-16

S 852.5

A

0517-6611(2015)16-150-02