李紹鋒， 王國紅， 饒佳媚， 楊民和, 2，*

1 福建師范大學生命科學學院, 福州 350117 2 工業(yè)微生物教育部工程研究中心, 福州 350117

豚草種帶內生真菌及其對種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

李紹鋒1， 王國紅1， 饒佳媚1， 楊民和1, 2，*

1 福建師范大學生命科學學院, 福州 350117 2 工業(yè)微生物教育部工程研究中心, 福州 350117

內生真菌是一類共生于植物體內，能夠不同程度影響宿主植物生態(tài)適應性和競爭能力的微生物。分析內生真菌在豚草種子中的分布、種群結構，以及內生真菌發(fā)酵液對種子發(fā)芽和幼苗生長的作用。結果顯示：發(fā)生于6個地區(qū)的豚草種子均能分離獲得內生真菌，分離率在19%—92.63%之間，不同地區(qū)之間差異極顯著(P<0.01)。內生真菌主要存在于種子的總苞部位，分離率達到65.52%。發(fā)生于福建省長樂市松下鎮(zhèn)的豚草種帶內生真菌種群包含5個屬，以鏈格孢屬(Alternaria)真菌為優(yōu)勢菌群，占82.26%；其次為鐮孢屬(Fusarium)真菌，占9.68%；其它3個屬的真菌發(fā)生較少，均低于5%。內生真菌主要以水平傳播方式在豚草不同世代之間傳播。供試的7個內生真菌菌株的發(fā)酵液均不同程度地抑制豚草種子發(fā)芽，降低幼苗地上部高度、根長度、根數(shù)量和總生物量，但不同菌株發(fā)酵液之間抑制程度差異明顯，顯示不同菌株對豚草種子發(fā)芽和幼苗生長產生不同的影響。內生真菌發(fā)酵液處理后的種子仍然保持較高程度的活力；不同內生真菌發(fā)酵液處理后，有活力的種子維持在50%—87.5%之間，均高于(或等于)清水處理的種子，說明內生真菌代謝產物只是抑制種子的發(fā)芽，但并不導致種子的腐爛和死亡。這些研究結果初步顯示種子攜帶的內生真菌可能在豚草入侵生物學中發(fā)揮重要的作用。

豚草；內生真菌；種群結構；種子發(fā)芽；幼苗生長

豚草(AmbrosiaartemisiifoliaL.)是原產于北美的一年生菊科植物，大約在20世紀30年代初傳入我國，目前已經擴散到我國的大部分地區(qū)[1-2]。豚草具有極強的繁殖能力和環(huán)境適應能力，是一種嚴重危害農業(yè)、生態(tài)和人體健康的惡性雜草[1]。豚草在生長季節(jié)產生大量的花粉，是引起夏秋季人類花粉過敏癥的主要過敏源，也是誘發(fā)支氣管哮喘、過敏性鼻炎和蕁麻疹的主要致病因子，已經成為世界性的公害[3]。

豚草超強的擴散和入侵能力與它的繁殖能力、種子特性和遺傳異質性相關[4-5]。當前，根據(jù)不同的情況，豚草的防治可以采用物理防除、藥劑治理、生物防治和生態(tài)防除等措施[6-7]。豚草的天敵包括植食性昆蟲、微生物及其他的生物因素[7-8]。在北美為害豚草的病原菌有25種以上，昆蟲有200種以上[7]。有關病蟲害對豚草的控制作用的研究，結論不一。相對于原產地加拿大，入侵地法國豚草的害蟲更少，但病原菌的影響沒有差異。在加拿大，雖然有一定數(shù)量的昆蟲和病原菌為害豚草，但病蟲害所造成的損失幾乎可以忽略不計，因為豚草有很強的耐受和補償能力[9]。而研究表明叢枝菌根真菌對豚草的迅速蔓延有很好的促進作用[10]。在我國的局部區(qū)域，引進天敵昆蟲對豚草具有一定的控制作用[11]；但是從世界范圍來看，由于豚草生長迅速，而天敵昆蟲繁殖滯后，在一定程度上影響最終的防治效果[7]，利用昆蟲和病原菌均難于達到理想的防治效果。

植物和微生物的互作是影響入侵植物種群建立和擴展的重要因素[12-13]。其中，內生真菌因為在植物體內發(fā)生極其普遍，具有一些特殊的生物學和生態(tài)學功能近年來受到廣泛的重視[14-15]。有關植物內生真菌的研究集中于植物的根、莖和葉子, 而種子攜帶的內生真菌的研究相對較少[16]。植物種子的表面和內部均攜帶有大量的微生物[17-18]；但這些微生物，特別是生長于種子組織內部的微生物的作用，目前還不清楚。

依據(jù)種子在豚草入侵和種群擴張中的重要作用，本文調查豚草種子的內生真菌，目的在于了解: (1) 豚草種帶內生真菌發(fā)生的普遍性和種群結構; (2) 內生真菌發(fā)酵液對豚草種子發(fā)芽和幼苗生長的作用。為全面評估內生真菌對豚草的影響效應和發(fā)掘新的生防資源提供依據(jù)。

表1 種子采樣地點和生境Table 1 Seed collection locations and habitats

1 材料與方法

1.1 樣地環(huán)境及種子采集

于2011年、2012年豚草種子成熟季節(jié)(7—9月)分別采集種子，采樣地點見表1，采樣點豚草發(fā)生歷史均在5a以上，發(fā)生于路邊的豚草零星分布，發(fā)生于荒地的豚草成片分布。每采樣地設置5個樣點，每個樣點隨機選取5植株，每一植株采集3個分枝上的種子，將每一采樣地點共25植株種子混合，用透氣袋裝好，放在陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 內生真菌分離

每個采樣地隨機挑選50粒飽滿、無霉變和蟲咬的種子，先在清水中浸泡過夜，清洗后撈出晾干。豚草種子實質上是一種具有木質化、堅硬果皮(總苞)的果實(瘦果)，每個果實中含有1粒種子[5]。本研究中，依習慣將豚草的瘦果稱為種子。研究種子不同部位真菌感染情況，則將苞片、總苞和種子(胚)分開, 分別作表面消毒處理。表面消毒的程序如下：先在75%酒精中浸泡30 s，再在3%次氯酸鈉(活性氯)溶液中浸泡8 min，后在75%酒精中再浸泡1 min，無菌水清洗3次，每次5 min，后于超靜工作臺中晾干。將上述經表面消毒處理過的材料，放置于 PDA平板上，每個平板放置6—8粒種子(或苞片、總苞)，于(28±1)℃恒溫黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每隔2 d定期觀察，待菌落出現(xiàn)后，采用菌絲尖端挑取法轉接至新鮮的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)；其后，分別挑取各菌落邊緣菌絲轉接于PDA斜面培養(yǎng)基上進行再培養(yǎng)。對純化后的菌株編號保存。

1.3 內生真菌的形態(tài)觀察

將分離純化的內生真菌無菌操作移接于PDA平皿中央，于(28±1)℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后，用無菌蓋玻片插片培養(yǎng)至菌體擴展到蓋玻片上并產生繁殖體；待培養(yǎng)10—15 d后，制片鏡檢，觀察、紀錄所有菌株的菌落特征，并用Canon Power Shot S110型相機拍攝菌落照片；用Olympus BX51型顯微鏡觀察和拍攝菌體、產孢結構和分生孢子照片。將觀察到的菌落特征、菌體形態(tài)和繁殖體形態(tài)，參照文獻[19-20]進行初步鑒定。

1.4 rDNA ITS 序列分析

1.4.1 菌體培養(yǎng)

將保存菌種于PDA平板上活化培養(yǎng)6—8 d，用直徑為0.5 cm的打孔器在菌落邊緣取菌餅接入裝有100 mL PD (Potato Dextrose, PD) 液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于(28±1)℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4—5 d，取菌體于4 ℃、8000 r/min離心10 min，獲得濕菌絲體，再用無菌蒸餾水將菌絲體清洗1次。將菌體轉移到無菌培養(yǎng)皿中，置于-80 ℃冰箱過夜。第2天取出菌體，用凍干機凍干。

1.4.2 基因組DNA的提取

基因組DNA提取采用CTAB (hexadecyltrimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化銨) 法，參照Edwards等的方法并略加改動[21]。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取4 μL樣品與1 μL的6×Loading Buffer混合，在質量濃度1%的瓊脂糖凝膠上電泳，0.5×TAE(Tris-Acetate-EDTA, TAE)為電泳緩沖液，電泳電壓90 V，0.5 h后，在溴化乙錠溶液中染色10 min，用水漂洗5 min，然后在Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)下檢測并攝像。

1.4.4 ITS區(qū)片段的擴增

nrDNA ITS區(qū)采用一對真菌通用引物ITS4和ITS5 擴增，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR反應體系(25 μL)為：10×PCR buffer (2.5 μL),dNTP (2.5 μL，2 mmol/L),ITS4 (1 μL, 10 μmol/L), ITS5(1 μL, 10 μmol/L)，樣品DNA (1 μL)，Taq酶 (0.25 μL)，超純水 (16.75 μL)。PCR擴增程序如下：95 ℃ 預變性5 min, 95 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，30個循環(huán)，72 ℃ 延伸補齊10 min，4 ℃保溫。

1.4.5 PCR產物檢驗

擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，0.5×TAE為緩沖液，5 V/cm電壓，上樣6 μL，設不加模板DNA的擴增產物為陰性對照，DNA Marker指示分子量，在溴化乙錠溶液中染色10 min后，用水漂洗5 min，然后在Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)下檢測并攝像。

1.4.6 PCR擴增產物純化

PCR產物電泳檢測后切膠，用生工生物工程(上海)有限公司的UNIQ-10柱式PCR產物純化試劑盒按說明書的要求回收擴增產物?；厥盏腄NA片段，可立即使用或保存于-20 ℃?zhèn)溆谩CR擴增產物送到生工生物工程(上海)有限公司作測序分析。

1.4.7 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

采用Sequin軟件將測序結果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，同時在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進行同源性比對，獲取同源性高的序列。利用BioEdit和Mega 4軟件將待測序列和NCBI中獲得的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 內生真菌的搖瓶培養(yǎng)

挑選分離自福建省長樂市松下鎮(zhèn)的7個菌株作搖瓶培養(yǎng)獲得發(fā)酵液。其中菌株AM-6、AM-8和AM-17為鏈格孢屬 (Alternariaspp.) 真菌，菌株AM-24為鐮孢菌屬(Fusariumsp.) 真菌、菌株AM-29為擬莖點霉屬(Phomopsissp.) 真菌、菌株AM-32為黑孢霉屬(Nigrosporasp.)和菌株AM-22為Stagonosporopsissp.。將菌種于PDA平板上活化培養(yǎng)6—8 d，用直徑為0.5 cm的打孔器在菌落邊緣制備菌餅4—6個，將菌餅接入250 mL三角瓶中培養(yǎng)，每瓶含100 mL PD培養(yǎng)液，置于(28±1)℃ 200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4—5 d，于4 ℃、8000 r/min離心10 min，去除菌絲體。將上清液用雙層濾紙過濾除去剩余的菌絲，然后通過砂芯過濾器將濾液依次通過孔徑為5.0、1.2 μm和0.22 μm的濾膜，制得無菌內生真菌發(fā)酵液。若發(fā)酵液太黏稠，要先作適當?shù)南♂屘幚?，然后將抽濾好的濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮到原先發(fā)酵液的濃度。

1.6 種子發(fā)芽測定

種子經浸泡、清洗后，在超凈工作臺中用無菌水洗滌3次并晾干。將已滅菌的濾紙片鋪在培養(yǎng)皿中，用鑷子夾取豚草種子置于濾紙片上，種子與種子之間有適當?shù)拈g距。在培養(yǎng)皿中倒入適量無菌水，以正好浸濕濾紙片為宜。后將培養(yǎng)皿置于(28±1)℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照12 h，黑夜12 h)，并及時添加無菌水保濕。

將配置好的MS培養(yǎng)基和菌株AM-17發(fā)酵液按7∶3混合后，倒入20 mm×200 mm的無菌試管中，每支試管加20 mL混合液。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在每支試管中放入1粒種子，置于(28±1)℃光照培養(yǎng)箱中(光照12 h，黑暗12 h)，每隔1 d觀察種子發(fā)芽情況，培養(yǎng)30 d后取出，計算發(fā)芽種子數(shù)量，并測量幼苗的生長情況。

1.7 種子活力測定

在發(fā)芽試驗中未發(fā)芽的種子，采用TTC (2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride, TTC) 法檢測種子活力[8]。

1.8 內生真菌發(fā)酵液對種子發(fā)芽的影響

將福建省長樂市松下鎮(zhèn)豚草產地采集的沙土用16目的篩子過篩后，于121 ℃間歇滅菌3次，每次20 min。滅菌后的沙土裝入無菌的平皿中，將已配制好的內生真菌發(fā)酵液倒入培養(yǎng)皿中使沙土充分濕潤，每個菌株發(fā)酵液設置5個重復，對照組用無菌水代替發(fā)酵液。用無菌鑷子將已在無菌水中浸漬0.5 h豚草種子放置在沙土表面，每個平皿中放置20粒種子，種子之間保持適當?shù)拈g距，將處理好的種子放置到(28±1)℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照12 h、黑暗12 h)，培養(yǎng)期間及時添加發(fā)酵液以保持沙土濕潤，隔天觀察種子發(fā)芽情況。培養(yǎng)30 d后，計算發(fā)芽率，測量幼苗的地上部、地下部長度和干重，計算須根的數(shù)量。

1.9 內生真菌發(fā)酵液對幼苗生長的作用

將福建省長樂市松下鎮(zhèn)采集的豚草幼苗，挑選生長較為一致的幼苗種植于裝有沙土的花盆中，每4棵為一簇，每簇之間控制適當?shù)拈g距，試驗組和對照組各3盆；試驗組澆灌菌株AM-17發(fā)酵液，對照組澆灌無菌水，每天澆灌10 mL，觀察幼苗生長情況，10 d后計數(shù)并拍照。

1.10 數(shù)據(jù)處理

真菌分離率(IR)表示分離到的某一指定內生真菌占分離樣品總數(shù)的百分率。采用Origin 9.1軟件和Microsoft Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理并作圖，差異顯著性分析采用SPSS18.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同產地豚草種子內生真菌分離

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2—3 d后，即可見豚草種子上有真菌長出。不同產地的豚草種帶真菌分離率差異極顯著(P<0.01)(圖1)。其中河北省廊坊市的豚草種帶內生真菌分離率最高，為92.63%，明顯高于其他產地豚草種子真菌分離率；福建省長樂市、湖南省汩羅縣和湖南省長沙市豚草種帶內生真菌分離率相近(P>0.05)，而江西省南昌市和福建省連城縣豚草種子的真菌分離率較低，分別為19%和21%。此外，從各地豚草種子分離出的內生真菌的菌落形態(tài)看，福建省長樂市的豚草種帶內生真菌種類較為豐富，而連城縣豚草種子所含內生真菌的種類較少。不同地區(qū)的豚草種子，其內生真菌菌落形態(tài)不盡相同。此外，也分離到一定數(shù)量的細菌(結果未顯示)。

2.2 種子不同部位內生真菌的分離

豚草種子(瘦果)的苞片、總苞和胚中均含有內生真菌(圖2)。其中總苞中內生真菌分離率為65.52%，明顯高于苞片和胚(種子)，差異達極顯著水平(P<0.01)。說明發(fā)生于豚草種子的內生真菌主要分布在其總苞中，而在苞片和胚中含量相對較少。

圖1 不同地區(qū)豚草種子內生真菌的分離(均值±標準誤) Fig.1 Isolation of endophytic fungi from seeds of Ambrosia artemisiifolia L. at different locations in China 柱狀圖上不同字母表示不同地區(qū)豚草種子發(fā)芽率在0.05水平上差異顯著

圖2 豚草種子不同部位真菌分離(均值±標準誤) Fig.2 Isolation of endophytic fungi from different parts of common ragweed achenes (average±SE) 柱狀圖上不同字母表示豚草種子不同部位真菌分離率在0.05水平上差異顯著

2.3 內生真菌的鑒定

為方便后續(xù)研究工作，對分離自福建省長樂市松下鎮(zhèn)的豚草種子內生真菌采用形態(tài)學和rDNA ITS序列分析相結合，進行歸類和鑒定。從2批次共94粒當年采集的豚草種子中，共分離獲得62株內生真菌，所有菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7—15 d后均能產生分生孢子, 依據(jù)菌體和分生孢子形態(tài)將62株內生真菌分為5個屬。

圖3 福建省長樂市豚草種子內生真菌種群結構 Fig.3 Relative abundance of fungal genera among endophytes in common ragweed seeds in a site of Changle city of Fujian province, China

供試菌株均擴增出分子量大小約為600 bp的目的片段。ITS片段測序包括引物序列的長度在527—570 bp范圍內，測得的序列使用Sequin軟件提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中。通過在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)同源性比對，得到序列同源性均高于98%。利用BioEdit和Mega 4軟件將待測序列和NCBI中獲得的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，62株內生真菌分屬于5個不同的類群，分別是51株鏈格孢屬(Alternaria)真菌，占82.26%；6株鐮孢屬(Fusarium)真菌，占9.68%；3株擬莖點霉屬(Phomopsissp.)真菌，占4.84%；1株黑孢霉屬(Nigrosporasp.)真菌(占1.61%)和1株Stagonosporopsis真菌(占1.61%)(圖3)。51株鏈格孢屬真菌中，形成一個可信度達到94獨立的分枝，其中包括A.arborescens，A.alternata和A.tenuissima等3種真菌(圖4)。

2.4 內生真菌發(fā)酵液對種子發(fā)芽的影響

與清水對照組(CK)相比，不同菌株發(fā)酵液處理的種子發(fā)芽均受到一定程度的抑制(圖5)。對照組的發(fā)芽率為86.52%，明顯高于內生真菌發(fā)酵液處理的種子，差異極顯著(P<0.01)；其中菌株AM-8和AM-17發(fā)酵液處理對種子發(fā)芽率抑制最為明顯，發(fā)芽率分別為17.11%和14.92%。菌株AM-22和菌株AM-32發(fā)酵液抑制作用居中，發(fā)芽率分別為31.21%和27.44%；而菌株AM-6、AM-24和AM-29發(fā)酵液抑制作用相對較差，發(fā)芽率分別為63.89%、63%和59%。

2.5 內生真菌發(fā)酵液處理對幼苗生長的影響

2.5.1 發(fā)酵液對幼苗地上部和根的影響

不同的內生真菌菌株發(fā)酵液處理對幼苗的株高和根長度產生不同程度的抑制作用(圖6—圖8)。其中菌株AM-8和AM-17發(fā)酵液對幼苗生長的抑制作用最為明顯。從地上部植株平均高度看，對照組(CK)植株最高為38.24 mm，而菌株AM-8和AM-17發(fā)酵液處理的幼苗明顯低于對照組和其他試驗組，分別為8.32 mm和5.62 mm；除菌株AM-6、AM-24和AM-29外(P>0.05)，其他4個菌株發(fā)酵液處理的幼苗高度與對照組相比差異達到極顯著水平(P<0.01)(圖6，圖7)。

從根的生長情況看，對照組根平均長度和根數(shù)量明顯高于內生真菌發(fā)酵液處理組。除AM-29外，其它6個菌株發(fā)酵液處理的幼苗根平均長度與對照相比達到極顯著水平(P<0.01) (圖7)；內生真菌發(fā)酵液處理后，豚草幼苗的根生長和發(fā)育受到明顯的抑制，對照組幼苗平均根數(shù)量最高，達到4.65；而菌株AM-8和AM-17處理組幼苗只有單獨的主根，不長側根和須根(圖6，圖8)。

用菌株AM-17發(fā)酵液定期定量澆灌豚草幼苗的試驗結果表明：真菌發(fā)酵液處理2 d后幼苗葉片開始發(fā)黃，到第5天植株開始枯萎死亡。菌株AM-17發(fā)酵液處理10 d后, 發(fā)酵液處理組幼苗死亡率達到77%，而對照組幼苗生長正常(表2)。菌株AM-17發(fā)酵液抑制效果明顯，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.5.2 內生真菌發(fā)酵液對幼苗總生物量的影響

試驗結果表明內生真菌發(fā)酵液處理對豚草幼苗的總生物量也產生不同程度的影響(圖9)，對照組(CK)幼苗總生物量均高于發(fā)酵液處理后的幼苗。從總生物量看，菌株AM-6和AM-29發(fā)酵液處理后豚草幼苗總生物量分別為0.0026 g和0.0029 g，與對照組差異不顯著(P>0.05)，其他發(fā)酵液處理后幼苗總生物量均明顯低于對照組，差異極顯著(P<0.01)。

2.6 種子活力測定

2.6.1 發(fā)酵液處理后未萌發(fā)種子的活力測定

采用TTC染色法檢測發(fā)酵液處理后未萌發(fā)種子的活力，結果見表3。在未萌發(fā)的種子中，清水處理(CK)的種子50%保持活力。菌株AM-24和AM-29發(fā)酵液處理后的種子存活率接近50%，與對照相比差異不顯著(P>0.05)；而AM-8、AM-22、AM-32、AM-17和AM-6等5個菌株發(fā)酵液處理后未萌發(fā)的種子中，活種子比例均超過64%，明顯高于清水處理的種子(P<0.01)。同時未萌發(fā)種子中，也有一定數(shù)量種子發(fā)生腐爛或空心。

圖4 基于ITS基因序列構建的NJ分子系統(tǒng)進化樹Fig.4 Neighbor-joining tree based on sequence analysis of the internal transcribed spacer (ITS) region節(jié)點旁數(shù)據(jù)表示重復計算1000次Bootstrap百分值，括號內為GenBank中序列的索取號

表2 菌株AM-17發(fā)酵液對幼苗生長的影響Table 2 Effects of strain AM-17 fermentation broth treatment on seedlings of common ragweed

圖5 內生真菌發(fā)酵液處理對豚草種子發(fā)芽的影響(均值±標準誤)Fig.5 Effects of fungal fermentation broth treatment on common ragweed seed germination (average ± SE)柱狀圖上不同字母表示豚草種子發(fā)芽率在0.05水平上差異顯著

圖6 內生真菌發(fā)酵液對幼苗生長的影響 Fig.6 Effects of fungal fermentation broth treatment on seedling growth of common ragweed

圖7 內生真菌發(fā)酵液處理對幼苗株高和根長度的影響(均值±標準誤)Fig.7 Effects of fungal fermentation broth treatment on aboveground and underground length of common ragweed seedlings (average ± SE) 柱狀圖上不同字母表示豚草幼苗株高和根長度在0.05水平上差異顯著

圖8 內生真菌發(fā)酵液對豚草幼苗總根數(shù)的影響(均值±標準誤) Fig.8 Effects of fungal fermentation broth treatment on root number of common ragweed seedlings (average ± SE) 柱狀圖上不同字母表示豚草幼苗總根數(shù)在0.05水平上差異顯著

2.6.2 MS培養(yǎng)基發(fā)芽試驗未萌發(fā)種子的活力測定

在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽試驗，菌株AM-17發(fā)酵液處理后，活種子占未萌發(fā)種子的比例為87.50%，高于對照組(73.91%)，但兩者均沒有出現(xiàn)腐爛種子(表4)。

3 討論與結論

植物種子中生活有豐富的微生物，但是傳統(tǒng)的研究大多數(shù)只局限于種子病原菌[22]，以及種子落入土壤后，土壤微生物對種子的腐敗作用[8]；有關種帶內生微生物種群的分析，則集中于牧草、草坪草種子[23]和少數(shù)

表3 真菌發(fā)酵液處理后未萌發(fā)豚草種子活力Table 3 Viability of ragweed seeds after fungal fermentation broth treatment

表4 MS培養(yǎng)基發(fā)芽試驗未萌發(fā)種子活力Table 4 Viability of ragweed seeds after fungal strain AM-17 fermentation broth treatment on MS medium

圖9 內生真菌發(fā)酵液處理對幼苗總生物量的影響(均值±標準誤)Fig.9 Effects of fungal fermentation broth treatment on seedling biomass of common ragweed (average ± SE) 柱狀圖上不同字母表示豚草幼苗總生物量在0.05水平上差異顯著

幾種農作物種子[24-25]。從入侵性植物的角度，Shipunov等比較了斑點矢車菊(Centaureastoebe)原產地和入侵地種帶內生真菌種群差異，分析種帶內生真菌的分布和起源。結果表明26%的斑點矢車菊種子含有內生真菌，一般每粒種子只被一種真菌所感染；每一個斑點矢車菊發(fā)生地平均可以分離獲得5種內生真菌；斑點矢車菊原產地種子和入侵地種子內生真菌種群結構是不盡相同的，在入侵地，每一種內生真菌的數(shù)量都較低(<16%)，即沒有真菌構成優(yōu)勢種群[16]。Rout等分析了假高梁(Sorghumhalepense)內生固氮細菌對宿主入侵的影響，內生細菌對假高梁的入侵產生明顯的促進作用[26]。豚草種帶內生真菌分離結果表明：當年成熟的種子中生長有豐富的內生真菌，這些內生真菌主要分布于總苞中(占65.52%)，苞片和胚中也有一定的分布(圖2)；大多數(shù)豚草種子中也只分離到一種內生真菌，但內生真菌的感染率在不同地區(qū)之間差異明顯(19%—92.63%)(圖1)。同時也發(fā)現(xiàn)：在豚草入侵地福建省長樂市松下鎮(zhèn)，鏈格孢屬真菌構成種帶內生真菌群落中明顯的優(yōu)勢菌群(占82.26%)，其次為鐮孢屬(Fusarium)真菌(占9.68%)；其它的真菌相對較少(均低于5%)(圖3)。這一結果支持植物內生真菌種群由少數(shù)種占優(yōu)勢的觀點[27]。一般認為：具有堅硬果皮(或種皮)的、成熟而有活力的植物種子很少被微生物感染[8]，但近年來這一觀念正在被研究結果所修正。成熟水稻[24]和玉米[25]種子普遍地含有內生細菌；禾本科牧草和草坪草種子普遍地被內生真菌所感染[22]。豚草種子實際上是一種小型瘦果，其果殼的堅硬程度比玉米、水稻、牧草和草坪草種皮強許多。豚草種子含有豐富的內生真菌，說明堅硬的果殼難于完全限制真菌在植物種子中的分布。

通過形態(tài)學鑒定和ITS區(qū)段序列分析，豚草種帶內生真菌大致歸為5個屬，分別是鏈格孢屬、鐮刀屬、擬莖點霉屬、黑孢霉屬和Stagonosporopsis屬，其中鏈格孢屬是明顯的優(yōu)勢菌群。本研究顯示，發(fā)生于豚草種子的鏈格孢屬真菌ITS序列分析的結果與形態(tài)學鑒定相吻合，可分為A.arborescens，A.tenuissima和A.alternata等3個種群。但是從系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，3個不同的種在同一分枝上，利用rDNA ITS分析不能夠嚴格區(qū)分(圖4)。因此，需要應用近年來發(fā)展的多基因序列分析作進一步的鑒定[19, 28]。

豚草是典型的一年生草本植物，其種群擴張完全依賴于種子存活和傳播。剛成熟的豚草種子不能發(fā)芽，須經歷冬季的寒冷后才能發(fā)芽，種子并有多次休眠特性[1, 4]。除正常的生理死亡外，動物捕食和微生物侵襲是造成土壤種子庫死亡的主要因素[8]。但是，在豚草原產地加拿大，和對照相比，殺菌劑處理種子和土壤并沒有提高豚草種子的出苗率，說明土壤真菌對豚草種子存活沒有明顯的影響[29]；而在豚草的近緣種三裂葉豚草(Ambrosiatrifida)，種子埋藏試驗表明土壤真菌對種子存活的影響也不大[8]。在法國，豚草土壤種子庫的死亡率在4%—74%之間，不同地區(qū)差異顯著，但對種子死亡原因未作進一步的分析[30]。土壤微生物和種傳微生物對豚草種子的具體作用目前還未見報道。本研究中所選用的7個內生真菌菌株，通過菌株發(fā)酵液澆灌種子萌發(fā)試驗，不同菌株的發(fā)酵液對種子的發(fā)芽率(圖5)、幼苗株高、根長度、根數(shù)量和總生物量都產生了不同程度的抑制作用(圖6—圖8)。其中菌株AM-17發(fā)酵液對豚草種子發(fā)芽、根、地上植株和總生物量的抑制作用最為明顯。菌株AM-17處理后，豚草種子發(fā)芽率只有14.92%(對照組的發(fā)芽率為86.52%)，而根和植株的發(fā)生受到嚴重的抑制，甚至造成植株的死亡。這些試驗結果說明內生真菌可能通過產生某種(或某些)代謝產物發(fā)揮作用；同時也說明，不同的內生真菌對宿主植物的影響是不同的。在斑點矢車菊的研究中，也得出相似的結果[31]。需要說明的是，內生真菌發(fā)酵液的影響只是間接的，而具體的、直接的影響尚需要通過菌株的人工接種予以明確。

種帶內生真菌對宿主植物的作用，大致可以表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)作為潛伏的病原菌(latent pathogens)，在一定條件下導致種子腐爛和幼苗的早期枯死；如發(fā)生于萵苣種子的灰霉菌(Botrytiscinerea)[32]和發(fā)生于玉米種子的輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)、黃曲霉(Aspergillusflavus)[33]；(2)作為拮抗菌，產生抗生素或類似的代謝產物保護宿主免受土壤病原菌的感染，提高種子成活率。如發(fā)生于玉米種子的玉米枝頂孢霉(Acremoniumzeae)[33]；(3)作為有益菌，產生它感物質或保護性化合物，抑制其它物種(包括植物、動物和微生物)的發(fā)生，有利于宿主種群的生存和擴散。如發(fā)生于大多數(shù)牧草和草坪草的香柱菌屬(Epichloe) (無性態(tài)：Neotyphodium屬)內生真菌[23]；(4)作為共棲菌，在一定的條件下恢復生長，降低種殼(或果皮)嚴密性，打破種子休眠，有利于種子的萌發(fā)。如發(fā)生于扭刺仙人掌(Opuntiastreptacantha)種子表皮的真菌[34]。研究結果顯示：室內培養(yǎng)條件下，內生真菌不通過種子發(fā)芽而進入豚草幼苗；供試的7個不同的內生真菌菌株，其發(fā)酵液均不同程度地抑制豚草種子的萌發(fā)；但未萌發(fā)的種子大多數(shù)保持活力(表3，表4)。已有的資料表明導致豚草超強生態(tài)適應能力的一個重要因素是種子休眠特性[4]，而具有堅硬的果皮可能是其中原因之一[1-2]。從本文研究結果分析，存在于豚草種子的內生真菌也可能是影響種子存活和休眠的原因之一，這一推測正確與否還需要進一步的試驗證明。

種子和幼苗是植物生活史的重要階段，受生物和非生物脅迫的影響最為明顯[2, 17, 31]，其對環(huán)境的適應性更能體現(xiàn)一個物種的競爭能力，決定一個物種的分布范圍和豐富程度。同時，種子和幼苗也是植物生活史的薄弱環(huán)節(jié)[17-18]，是雜草防控中的關鍵時期。豚草種子中含有豐富的內生真菌，這是豚草研究中的首次報道。作為一類新的微生物資源，種帶內生真菌在豚草入侵生物學中的作用，值得進一步分析和探討。

致謝: 中國農業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室劉萬學副研究員、陳紅松先生惠贈豚草種子，特此致謝。

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Effects of endophytic fungi from common ragweed on seed germination and seedling development of its host plant

LI Shaofeng1， WANG Guohong1， RAO Jiamei1， YANG Minhe1, 2，*

1CollegeofLifeScience,FujianNormalUniversity,Fuzhou350117,China

2EngineeringResearchCenterofIndustrialMicrobiologyAffiliatedtoMinistryofEducation,FujianNormalUniversity,Fuzhou350117,China

Endophytic fungi are microbes that live asymptomatically inside plant tissues. Accumulating research studies suggest that endophytic fungi have a fundamental influence on the fitness and competitiveness of their host plants. Here, we surveyed the species diversity and community structure of endophytic fungi associated with the seeds of common ragweed (AmbrosiaartemisiifoliaL.), which is a notorious invasive weed belonging to theAsteraceaefamily in China. The main objective was to document the distribution of the fungal symbionts and to determine at what point endophytic fungi affect seed germination and seedling development in common ragweed. Endophytic fungi were found in all common ragweed populations collected from six study locations in China, with fungal isolation rates ranging from 19% to 92.63%. Yet, the isolation rates of endophytic fungi were significantly different (P< 0.01) among all six locations, with the highest isolation rate being obtained from seeds collected from Langfang City, Hebei Province. The endophytes in common ragweed seeds were predominantly isolated from involucre, with the isolation rate reaching 65.52%. The fungal isolation rates were 21.74% for seeds and 18.18% for bracks, respectively. Five fungal genera were detected in common ragweed seeds collected from Changle City, Fujian Province. The most frequent genera of the endophytic community wereAlternariaandFusarium, which accounted for 82.26% and 9.68% of isolates, respectively. Three genera were indicated as rare endophytes in common ragweed seeds, none of which exceeded 5% of isolates. Our data indicate that endophytes from common ragweed seeds are horizontally transmitted to the next generation, because no endophytic fungi were detected in newly developed seedlings. After determining the fungal genera and their relative abundance, an experiment was conducted with fermentation broths from seven representative isolates of common endophytic fungi that are present inA.artemisiifoliaseeds. The germination of common ragweed seeds and subsequent seedling development were inhibited when seeds were treated with fermentation broths from seven endophytic fungal isolates. The germination of common ragweed seeds noticeably declined (P< 0.01) when treated with fermentation broths of the seven selected fungal isolates. Fermentation broths of strain AM-17 and AM-8 had the highest inhibition effects on seed germination. The germination percentages of seeds treated with strain AM-17 and AM-8 fermentation broths were 14.92% and 17.11%, respectively, whereas the germination percentage of seeds treated with water (control) reached 86.52%. The experiments also showed that the growth of common ragweed seedlings is inhibited by treatment with fungal fermentation broths. Four out of seven fungal fermentation broths significantly (P< 0.01) reduced the aboveground stem length of common ragweed seedlings when compared to the water treatment (control). Strains AM-8 and AM-17 inhibited seedling growth the greatest. Six of seven fungal fermentation broths significantly (P< 0.01) reduced the root length of seedlings, while all fungal fermentation broths significantly (P< 0.01) reduced lateral root number. In striking contrast, lateral roots failed to develop when seedlings were treated with the fermentation broth of strains AM-17 and AM-8. Five out of the fermentation broths significantly (P< 0.01) reduced the biomass of common ragweed seedlings. Seventy-seven percent of seedlings were dead after treatment with the fermentation broth of strain AM-17 for 5 days. Seed survival was not severely (P> 0.05) affected by fungal fermentation broth treatments. Seed viability analysis indicated that most seeds (50%—87.5%) were viable after the various fungal fermentation broth treatments. Our data demonstrate that metabolites produced in fungal fermentation broths do not facilitate seed germination, but did not kill the seeds.

Ambrosiaartemisiifolia; endophytic fungi; community; seed germination; seedling development

2014- 02- 10;

日期:2015- 04- 14

10.5846/stxb201402100229

*通訊作者Corresponding author.E-mail: minhe214@fjnu.edu.cn

李紹鋒,王國紅,饒佳媚， 楊民和.豚草種帶內生真菌及其對種子發(fā)芽和幼苗生長的影響.生態(tài)學報,2015,35(21):7011- 7022.

Li S F, Wang G H, Rao J M, Yang M H.Effects of endophytic fungi from common ragweed on seed germination and seedling development of its host plant.Acta Ecologica Sinica,2015,35(21):7011- 7022.