林煒明 戴愛玲 尹會方 楊小燕 (龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364000)

人外周血巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及功能鑒定①

林煒明 戴愛玲 尹會方 楊小燕②(龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364000)

目的:從人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中分離單核細(xì)胞，誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞并鑒定其功能。方法:應(yīng)用免疫磁珠法從人外周血單個核細(xì)胞中分選CD14+單核細(xì)胞，分離后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測其純度，用含有10%人AB血清和10 ng/ml人M-CSF的IMDM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)CD14+單核細(xì)胞，誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞，并進(jìn)行形態(tài)特征和吞噬功能鑒定。結(jié)果:免疫磁珠法能從外周血中分離到高純度的CD14+單核細(xì)胞，分選前CD14陽性率為10%，分選后CD14陽性率為85.8%。誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后巨噬細(xì)胞的直徑最大可達(dá)40～45 μm，大部分細(xì)胞呈煎蛋狀，能有效地吞噬淋巴瘤Raji細(xì)胞。結(jié)論:從外周血中分離了高純度的CD14+單核細(xì)胞，誘導(dǎo)形成的巨噬細(xì)胞具有吞噬淋巴瘤細(xì)胞的功能。

巨噬細(xì)胞;磁珠分選;培養(yǎng);功能鑒定

單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)包括血液中的單核細(xì)胞和組織中固定或游走的巨噬細(xì)胞，具有吞噬功能。單核細(xì)胞來源于骨髓干細(xì)胞，在骨髓中經(jīng)前單核細(xì)胞分化發(fā)育為單核細(xì)胞，然后由骨髓釋放入血，經(jīng)過血液循環(huán)便移行到各個組織中，分化成組織中的巨噬細(xì)胞。所有巨噬細(xì)胞包括炎癥位點和穩(wěn)態(tài)下定居于組織中的均由單核細(xì)胞衍生而來[1]。在體外培養(yǎng)時，單核細(xì)胞在含有血清或巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)培養(yǎng)中分化成巨噬細(xì)胞[2]。CD14是一種通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞膜表面脂質(zhì)豐富的區(qū)域，而在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等表面則未發(fā)現(xiàn)CD14的存在，目前已被廣泛用來鑒定單核巨噬細(xì)胞[3，4]。本實驗通過采集健康成人新鮮外周血，應(yīng)用免疫磁珠法捕獲CD14+單核細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)分化為巨噬細(xì)胞，建立高純度的人外周血來源巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，并鑒定其吞噬淋巴瘤細(xì)胞的功能，為免疫細(xì)胞的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 IMDM、胎牛血清、人AB血清和TrypLE購自 Life Technology公司;人 M-CSF購自eBiosciences公司;Primocin購自 Invivogen公司;人CD14正選試劑盒和人CD14抗體(clone MoP9，APC標(biāo)記)以及EasySep專用磁極購自Stemcell Technologies公司。

1.2 免疫磁珠法分離單核細(xì)胞 采集健康成人新鮮外周抗凝血，用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，用洗液(含2%FBS的PBS)洗滌，懸浮細(xì)胞并計數(shù)，PBMC可放在液氮長期保存，解凍后的PBMC可用DNaseⅠ室溫孵育15 min后用30 μm的尼龍網(wǎng)過濾后重新計數(shù)，2.0×108個PBMC用來CD14正選，加入200 μl EasySep抗體正選試劑盒，用移液器輕輕上下吹打均勻，室溫孵育15 min，再加100 μl EasySep納米磁珠，充分混勻后室溫孵育10 min，輕輕混勻后將試管放入專用磁極中靜止5 min，將磁極連試管一起拿起，倒出上清部分。用洗液重新混勻后重復(fù)2次過程。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分析單核細(xì)胞分離純度 分別取分選前的PBMC、分選所得的CD14+單核細(xì)胞以及分流柱流出的細(xì)胞各5 ×105個細(xì)胞，加入2.5 μl人CD14-APC抗體(clone MoP9)，用抗鼠IgG單克隆抗體做同型對照，4℃避光孵育30 min，洗滌后用洗液懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分選前后細(xì)胞CD14的表達(dá)情況，以同型對照的細(xì)胞作為對照，計算細(xì)胞的CD14陽性率。

1.4 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察 配置含10%人AB血清和10 ng/ml人M-CSF的IMDM培養(yǎng)液，加入8 ml新鮮培養(yǎng)液于10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中CD14+單核細(xì)胞數(shù)為5×106個細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)期間不換液。在第1、3、6天時倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的活力及形態(tài)，包括貼壁狀態(tài)，體積、形態(tài)、偽足的變化。

1.5 吞噬Raji細(xì)胞實驗

1.5.1 CFSE標(biāo)記淋巴瘤Raji細(xì)胞 1.0×106個淋巴瘤Raji細(xì)胞懸浮于0.5 μmol/L CFSE熒光染料(PBS稀釋)中，室溫避光孵育2 min，立即加入FBS使FBS的含量為10%，37℃避光水浴10 min，離心洗滌后懸浮細(xì)胞，制備成CFSE標(biāo)記淋巴瘤Raji細(xì)胞。

1.5.2 吞噬功能檢測 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)到第7天時，PBS洗滌，用TrypLE消化15～20 min，收集巨噬細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整巨噬細(xì)胞濃度至1.0×106個/ml，作為效應(yīng)細(xì)胞。調(diào)整CFSE標(biāo)記的Raji細(xì)胞濃度調(diào)整至2.0×106個/ml，作為靶細(xì)胞。各取50 μl效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞(效靶比為1∶2)加至96孔板，離心后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，洗滌后懸浮細(xì)胞，每孔加人1 μl抗CD14-APC抗體，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測吞噬率。

2 結(jié)果

2.1 單核細(xì)胞分離及純度鑒定 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示(圖1)，免疫磁珠分選前CD14陽性細(xì)胞占PBMC的10%，分選后收獲的CD14陽性細(xì)胞群中CD14陽性率為85.8%，而CD14陰性細(xì)胞群中CD14陽性率為0.3%。表明采用免疫磁珠陽性分選可以獲得高純度的CD14+細(xì)胞。

2.2 CD14+單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化 CD14+細(xì)胞在10%人AB血清和10 ng/ml人M-CSF的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，期間無需更換培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，培養(yǎng)24 h后，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，細(xì)胞體積仍然較小，少量細(xì)胞伸出很短的偽足(圖2A)。培養(yǎng)到第3天時，細(xì)胞體積增大，偽足伸展明顯(圖2B)。培養(yǎng)到第6天時，偽足沒有進(jìn)一步增加和伸展，細(xì)胞貼壁牢固，體積進(jìn)一步明顯增大，較大的細(xì)胞直徑可達(dá)40～45 μm，形狀從不規(guī)則形逐漸變成橢圓形，大部分細(xì)胞呈煎蛋狀，少數(shù)為長梭形，培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞與第三天時相比無明顯區(qū)別(圖2C)。

圖1 CD14陽性細(xì)胞純度流式檢測結(jié)果峰圖Fig.1 Flow cytometry graph of purity analysis of CD14 positive cellsN

圖2 巨噬細(xì)胞形態(tài)特征Fig.2 Morphological features of macrophages

圖3 巨噬細(xì)胞吞噬功能流式檢測結(jié)果峰圖Fig.3 Flow cytometry graph of phagocytosis function of macrophage

2.3 巨噬細(xì)胞吞噬功能 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)到第7天時，流式細(xì)胞儀檢測CD14陽性率，CD14+細(xì)胞在數(shù)量上有部分減少，陽性率為46%。根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)[5]及貼壁生長的特性[6]，此時培養(yǎng)板中生長的絕大多數(shù)是巨噬細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)和靶細(xì)胞(CFSE標(biāo)記的淋巴瘤Raji細(xì)胞)混合培養(yǎng)2 h后，用CD14-APC對巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測吞噬率(圖3)。結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞與淋巴瘤細(xì)胞作用后，82%巨噬細(xì)胞(包括CD14陽性和陰性)吞噬了淋巴瘤細(xì)胞，83%的CD14+巨噬細(xì)胞吞噬了Raji細(xì)胞，表明培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞有很強(qiáng)的吞噬功能。

3 討論

單核-巨噬細(xì)胞是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，具有吞噬和殺傷、遞呈抗原和啟動免疫應(yīng)答以及抗腫瘤等功能[2]。研究者可以從外周血中分離單核細(xì)胞，誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞進(jìn)行功能研究[3]。免疫磁珠法是近年來細(xì)胞分選的重要技術(shù)，具有磁性的微顆粒通過結(jié)合特定抗體，在液相中能特異性地與相應(yīng)抗原相結(jié)合，依靠磁場的作用力快速地使所需樣品得到大大的濃縮[7]。CD14為單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)特征性的表面標(biāo)記，本實驗通過人CD14正選試劑盒，應(yīng)用免疫磁珠法分離單核細(xì)胞，CD14陽性細(xì)胞率從分選前的10%提高到85.8%，得到了高純度的單核細(xì)胞。在人CD14正選試劑盒中，抗CD14抗體克隆號為BA-8，免疫磁珠分選后，一些抗原位點已被抗體封閉，所以在進(jìn)行流式儀檢測CD14+細(xì)胞純度時，選用了克隆號為MoP9的抗CD14抗體，結(jié)果可以看出，該克隆抗體能跟CD14抗原的其他位點結(jié)合，較好地反映出細(xì)胞表面CD14抗原的表達(dá)量。

體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性，在GM-CSF、IL-4以及肝素刺激下，單核細(xì)胞可向樹突狀細(xì)胞分化[8]，在M-CSF刺激下可誘導(dǎo)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化[2]，原因是M-CSF可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)，進(jìn)而導(dǎo)致磷酸酶SHP1氧化，氧化的磷酸酶可通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞的增殖分化[9]。加上含有高濃度同源血清來替代胎牛血清的培養(yǎng)體系則可以成功培養(yǎng)出巨噬細(xì)胞[10]?；谶@些因素，本實驗用10%人AB血清來替代胎牛血清，再加上10 ng/ml M-CSF刺激，成功培養(yǎng)了大量巨噬細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)到第7天時，巨噬細(xì)胞牢固貼壁在培養(yǎng)板上，而一些未分化的單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞將脫壁懸浮生長[6]，有利于巨噬細(xì)胞的進(jìn)一步純化。

CD14+細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)7 d后，收集巨噬細(xì)胞，本實驗用TrypLE來替代Trypsin消化15～20 min，TrypLE對細(xì)胞損傷小，無需Trypsin抑制劑，更有利于下一步巨噬細(xì)胞的功能檢測。用流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)第7天時CD14陽性率，表明CD14陽性率依然很高，但也有一大部分細(xì)胞不表達(dá)CD14分子。從顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)來看，絕大部分細(xì)胞呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞形態(tài)，與文獻(xiàn)報道的形態(tài)相一致[5]。Erbel等[4]也研究表明，單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)后CD14分子下調(diào)，而白細(xì)胞分子CD45RO保持不變。巨噬細(xì)胞的吞噬活性是巨噬細(xì)胞的重要功能特性，也是巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑。本研究對培養(yǎng)分化得到的巨噬細(xì)胞進(jìn)行吞噬淋巴瘤Raji細(xì)胞實驗，表明體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞吞噬Raji細(xì)胞的功能強(qiáng)，83%的CD14+巨噬細(xì)胞吞噬了Raji細(xì)胞。但在組織微環(huán)境中，由于巨噬細(xì)胞受到其他細(xì)胞分泌因子的刺激等眾多因素的影響，其功能也發(fā)生相應(yīng)變化[11]。體外檢測巨噬細(xì)胞吞噬Raji細(xì)胞的實驗方法建立也有助于藥物開發(fā)，研究人員認(rèn)為CD47抗體是一種新型抗淋巴瘤藥物，巨噬細(xì)胞表達(dá)Fc受體，識別包被于淋巴瘤細(xì)胞上的CD47抗體Fc段，加強(qiáng)了巨噬細(xì)胞吞噬淋巴瘤細(xì)胞功能[12]。本文從外周血中分離了高純度的CD14+單核細(xì)胞，誘導(dǎo)形成的巨噬細(xì)胞具有很好的吞噬淋巴瘤細(xì)胞的功能，為進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞生物學(xué)作用、新型抗癌藥物開發(fā)創(chuàng)造了條件。

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[收稿2014-08-20 修回2014-09-10]
(編輯 倪 鵬)

Culture and functional identification of macrophages from human peripheral blood

LIN Wei-Ming，DAI Ai-Ling，Yin Hui-Fang，YANG Xiao-Yan.College of Life Sciences of Longyan University，Longyan 364000，China

Objective:To isolate monocytes from human peripheral blood mononuclear cells(PBMC)，induce macrophages，and identify the function of macrophages.MethodsMonocytes were isolated from PBMC using magnetic activated cell sorting(MACS)anti-CD14 microbead.Sorted CD14+and CD14－cells were checked by flow cytometer to evaluate the efficiency of sorting.The sorted CD14+cells were cultured in IMDM media with 10%human AB serum and 10 ng/ml M-CSF for 7 days to generate macrophages，which were identified by morphological features and phagocytosis function.ResultsA high purity of monocytes was obtained by MACS anti-CD14 microbead.The percentage of CD14+cells was 10%and 85.8%before and after sorting，respectively.The macrophages were approximately 40-45 μm in maximum diameter and had the fried egg colony morphological features after 7 days culture.The lymphoma (Raji)cells were efficiently engulfed by macrophages.ConclusionThe high purity of CD14+monocytes is isolated from PBMC and monocyte-derived macrophages efficiently engulfed lymphoma cells.

Macrophages;Magnetic activated cell sorting;Culture;Functional identification

R292.12

A

1000-484X(2015)01-0086-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2015.01.018

①本文受福建省教育廳JK類項目(No.JK2011053)、福建省科技計劃重點項目(2013N0026)資助。

②福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)高校重點實驗室(龍巖學(xué)院)，龍巖364000。

林煒明(1976年－)，男，博士，副教授，主要從事動物免疫學(xué)方面研究，E-mail:wmlin925@126.com。

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