肖 梅，王 麗，劉倩雯，高文遠(yuǎn)

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津300072;2.天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津300072)

人體在利用氧進(jìn)行生命活動的過程中，會因各類內(nèi)在或外在刺激因素產(chǎn)生各種強(qiáng)活性自由基，主要有活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)。正常機(jī)體內(nèi)自由基的代謝維持動態(tài)平衡，自由基的清除主要依賴體內(nèi)的生物酶抗氧化劑(超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px等)和非生物酶抗氧化劑(維生素E、維生素C等)。當(dāng)人體內(nèi)的自由基累積過多，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化防御功能之間的平衡被打破時，就會誘發(fā)氧化應(yīng)激從而引起多種疾病。研究顯示，由于氧化失衡引起的疾病已超過100多種，而采用外源抗氧化劑治療已在動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病等多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［1］。

抗氧化劑是一類能捕獲、清除自由基的物質(zhì)，可以恢復(fù)機(jī)體內(nèi)氧化/抗氧化平衡，進(jìn)而消除(或減輕)自由基對人體的損害?？寡趸瘎└鶕?jù)來源可分為天然抗氧化劑和合成抗氧化劑［2］。其中，天然抗氧化劑是此研究領(lǐng)域的熱點，如 α、β、γ、δ-生育酚、黃酮類物質(zhì)［3］和茶多酚［4］等。 近年來，天然多糖抗氧化劑因具有良好的安全性和生物相容性等優(yōu)點，備受關(guān)注。例如，菊芋菊糖能夠有效的降低糖尿病(DM)大鼠的MDA值，升高SOD值，降低總膽固醇(TC)含量［5］，改善二型糖尿病的女性患者的糖化血紅蛋白、MDA水平等抗氧化指標(biāo)，提高其總抗氧化能力和SOD活性［6］;天然靈芝多糖可降低糖尿病患者的血糖含量［7］，并隨著多糖濃度增加，其對羥基自由基(·OH)清除能力增強(qiáng)［8］。

殼聚糖(chitosan，Cs)是迄今自然界發(fā)現(xiàn)的唯一堿性 多 糖［9］，主 鏈 由 2-氨 基-2-脫 氧-β-D-葡 聚糖 組成，具有清除體內(nèi)自由基、保護(hù)機(jī)體免受過氧化損傷的能力［10］，可作為潛在的抗氧化生物材料［11］。本課題組之前通過測定大鼠血清、肝臟以及腎臟中SOD活性和MDA含量，發(fā)現(xiàn)一定劑量和一定相對分子質(zhì)量范圍的殼聚糖及其衍生物，可使血清、肝臟和腎臟中SOD活性明顯提高，MDA含量有所降低，證實了低相對分子質(zhì)量的殼聚糖及其衍生物具有體內(nèi)抗氧化活性［12］。鑒于此，本研究設(shè)計通過體外細(xì)胞實驗，以Vc為參照物，評價殼聚糖的抗氧化活性，研究殼聚糖對氧化損傷細(xì)胞的修復(fù)作用，以揭示殼聚糖體內(nèi)抗氧化活性的機(jī)理。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

HepG2細(xì)胞、高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、抗壞血酸(Vc)、殼聚糖(Cs)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、SOD試劑盒、GSHPx試劑盒、丙二醛試劑盒。

振蕩培養(yǎng)箱、冷凍干燥機(jī)、離心機(jī)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、微量振蕩器、酶標(biāo)儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖對HepG 2細(xì)胞毒性實驗

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)，傳代，凍存，復(fù)蘇后，在 96孔板中接入細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后，進(jìn)行給藥處理。給藥組含2個樣品(Vc，Cs)，每個樣品設(shè)高、中、低3個劑量(60，300，600 g/L)，正常組只給予培養(yǎng)液，給藥處理24 h后，MTT法測定細(xì)胞活力，對比給藥組與正常組細(xì)胞活力，觀察Vc和 Cs對細(xì)胞的毒性。

1.2.2 殼聚糖對氧化損傷HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

采用濃度為50μmol/L H2O2作用HepG2細(xì)胞2 h，在24孔板中，將 H2O2損傷組分為氧化損傷模型組、Vc組、殼聚糖組。去上層培養(yǎng)液，分別進(jìn)行給藥處理，如表1所示。將上述實驗組置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中干預(yù)24 h。干預(yù)結(jié)束后，對細(xì)胞染色，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。

表1 實驗分組Table 1 The experim ent group

1.2.3 殼聚糖對氧化損傷HepG 2細(xì)胞活力的影響

如1.2.2中氧化損傷HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入15μL 5 g/L的 MTT，培養(yǎng)4 h后，吸出孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入200μL二甲基亞砜，振蕩，使結(jié)晶物充分溶解，于490 nm波長下測定OD值。

1.2.4 殼聚糖對氧化損傷HepG 2細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

對HepG2細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入500μL的雙蒸水，離心2 min，離心后去上層液體。加入200μL RIPA裂解液充分裂解，于4℃ 12 000 r/m in離心10 m in后，收集上層清液。并向其中加入不同劑量Vc和殼聚糖(如表1)。通過測定其吸光度即可計算出蛋白濃度，通過測定各管吸光度及已知蛋白濃度即可算出總SOD活力、MDA的含量和GSH-Px活力值。

1.3 統(tǒng)計分析

本研究中采用SPSS軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)組間的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖細(xì)胞毒性實驗

用Vc和殼聚糖干預(yù)正常 HepG2細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示Vc和殼聚糖高中低劑量組細(xì)胞活力接近或高于正常，依據(jù) GB/T16886.5-2003中所描述的MTT法體外細(xì)胞毒性實驗，表明Vc和殼聚糖對細(xì)胞的毒性為0級。

圖1 Vc和殼聚糖對HepG2細(xì)胞活力影響Fig.1 Effects of Vc and chitosan on the activity of HepG2 cells

2.2 殼聚糖對氧化損傷HepG2細(xì)胞形態(tài)的修復(fù)

于倒置相差顯微鏡下，觀察 HepG2細(xì)胞形態(tài)，如圖2所示。

圖2 Vc和殼聚糖對氧化損傷細(xì)胞形態(tài)影響(×200)Fig.2 E ffects of Vc and chitosan on the m orphology of oxidative dam age cells(×200)

圖2 a)顯示正常組的細(xì)胞貼壁生長，生長良好，細(xì)胞邊界連接緊密，呈現(xiàn)橢圓形或圓形，多核仁，胞漿豐富，細(xì)胞形態(tài)飽滿。H2O2氧化損傷后細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞收縮聚攏，胞核模糊，胞漿明顯變少［圖2b)］。

圖2c)、圖2d)和圖2e)為用不同劑量 Vc修復(fù)的細(xì)胞形態(tài)，與模型組相比，高中低劑量Vc對氧化損傷HepG2細(xì)胞形態(tài)的修復(fù)效果不明顯。

與Vc的作用效果相比，添加不同劑量殼聚糖的細(xì)胞形態(tài)［圖2 f)、圖2g)和圖2h)］均有改善，尤其是殼聚糖中劑量組，細(xì)胞生長良好，胞漿豐富，細(xì)胞邊界連接清晰，形態(tài)飽滿，證明殼聚糖對氧化損傷HepG2細(xì)胞形態(tài)具有明顯的修復(fù)效果。

2.3 殼聚糖對氧化損傷HepG 2細(xì)胞活力的修復(fù)

與模型組相比，不同劑量的 Vc和殼聚糖都可以提高氧化損傷細(xì)胞的活力(參見表2)。其中，Vc對損傷細(xì)胞活力的恢復(fù)作用并不明顯，而殼聚糖提高氧化損傷細(xì)胞活力的效果隨其濃度而變化，中劑量組具有最佳的修復(fù)效果，氧化損傷細(xì)胞活力提高近50%。

表2 Vc和殼聚糖對氧化損傷細(xì)胞活力影響Table 2 Effects of Vc and chitosan on the activity of oxidative dam age cells

2.4 殼聚糖對氧化損傷HepG2細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

2.4.1 殼聚糖對氧化損傷HepG2細(xì)胞SOD、M DA指標(biāo)的影響

SOD是機(jī)體內(nèi)一種清除自由基的酶，可以有效減少活性氧對機(jī)體產(chǎn)生的氧化損傷，SOD含量越高，機(jī)體氧化損傷越輕。MDA是機(jī)體的脂過氧化產(chǎn)物，MDA含量越高，脂過氧化產(chǎn)物越多，表明機(jī)體所受的氧化損傷越嚴(yán)重。

表3 Vc和殼聚糖對氧化損傷細(xì)胞抗氧化指標(biāo)影響Table 3 Effects of Vc and chitosan on an tioxidant index of oxidative dam age cells

由表3數(shù)據(jù)可見，Vc和殼聚糖對氧化損傷HepG2細(xì)胞SOD和MDA水平均有影響。與模型組相比，Vc提高SOD含量的作用更顯著，且中劑量效果最好，但Vc降低MDA的效果不明顯，低、高劑量甚至還提高了 MDA含量。而殼聚糖中、高劑量組卻展現(xiàn)了良好的降低MDA含量的效果，但二者沒有對SOD含量的提高作用;殼聚糖低劑量組雖然可以很好的提高SOD含量，同時卻也提高了MDA水平。就本實驗數(shù)據(jù)而言，Vc的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性體現(xiàn)在提高SOD含量上，而殼聚糖的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性則體現(xiàn)在降低MDA含量上。

2.4.2 殼聚糖對氧化損傷HepG 2細(xì)胞GSH-Px活性影響

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)清除自由基的酶，其活力直接或間接反映了機(jī)體抗氧化能力。GSH-Px活性越大，其抗氧化能力越強(qiáng)。

表4 Vc和殼聚糖對氧化損傷細(xì)胞GSH-Px活性的影響Table 4 Effects of Vc and chitosan on GSH-Px activity of oxidative dam age cells

參見表4，與模型組相比，Vc和殼聚糖中劑量組都可以提高氧化損傷細(xì)胞的 GSH-Px活性。其中，殼聚糖提高氧化損傷細(xì)胞GSH-Px活性的效果比Vc要好，甚至超過正常組。

3 結(jié)論

綜合分析不同劑量殼聚糖對氧化損傷HepG2細(xì)胞的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氧化受損HepG2細(xì)胞中，殼聚糖可通過提高GSH-Px的活性和降低MDA的含量發(fā)揮其抗氧化活性，進(jìn)而對氧化損傷HepG2細(xì)胞的形態(tài)和活力具有修復(fù)作用。與 Vc相比，殼聚糖對氧化損傷HepG2細(xì)胞的形態(tài)和活力的修復(fù)效果更明顯，降低MDA含量和提高GSH-Px活性的能力更強(qiáng)。

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