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        P2X3受體在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型中的作用

        2015-02-03 08:07:43納仁高娃米焱杜禹沈艷肖建新呂東
        中國當(dāng)代醫(yī)藥 2014年36期
        關(guān)鍵詞:糖尿病

        納仁高娃+米焱+杜禹+沈艷+肖建新+呂東晨+艾麗雅+牛思琪

        [摘要] 目的 觀察P2X3受體在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中的作用和意義。 方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為造模組(n=30)和對照組(n=10)。按照60 mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。于STZ注射前和注射后第7、14、28天分別測定大鼠血糖、體重以及機(jī)械性痛閾的變化。造模組又均分為造模1周組、造模2周組、造模4周組三個亞組。在造模前及造模后1、2、4周利用von Frey hairs法測定大鼠機(jī)械痛閾,并通過Real-time法測定每個時間點(diǎn)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3受體的表達(dá)水平。 結(jié)果 肉眼觀察糖尿病大鼠毛色暗淡,尾靜脈采血點(diǎn)愈合緩慢,每日飲水,飲食,尿量顯著增加,表現(xiàn)符合糖尿病大鼠的臨床特征。各模型組血糖濃度均>16.7 mmol/L,各模型組與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。糖尿病大鼠體重較對照組同期大鼠增長緩慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。造模組機(jī)械痛閾在造模1周后明顯下降(P<0.01),并持續(xù)至4周(P<0.01);在造模1周后脊髓DRG內(nèi)P2X3受體表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.01)。大鼠P2X3受體表達(dá)水平變化與機(jī)械痛閾的下降存在相關(guān)性。 結(jié)論 糖尿病早期大鼠脊髓DRG P2X3受體表達(dá)即出現(xiàn)上調(diào),并與疼痛相關(guān),說明P2X3受體可能在糖尿病大鼠周圍神經(jīng)疼痛的發(fā)生及痛敏的維持階段起重要作用。

        [關(guān)鍵詞] 糖尿病;P2X3受體;背根神經(jīng)節(jié);Real-time法;大鼠

        [中圖分類號] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721(2014)12(c)-0004-04

        糖尿病的發(fā)病率隨著生活水平的提高不斷上升,嚴(yán)重危害人們的健康,神經(jīng)病理性疼痛是目前危害糖尿病患者的主要慢性并發(fā)癥之一,臨床表現(xiàn)為感覺異常和疼痛,其中對機(jī)械刺激表現(xiàn)異常疼痛,稱為痛性糖尿病周圍神經(jīng)病,由于機(jī)制尚不明確,很難治療或無法治愈[1-5]。P2X3受體的基本結(jié)構(gòu)屬于配體門控離子通道,P2X3受體亞基最初由脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)分離出來[6-7]。神經(jīng)損傷后組織釋放大量ATP,一方面激活突觸后膜P2X3受體,使細(xì)胞膜去極化,Ca2+內(nèi)流,介導(dǎo)快速突觸傳遞;另一方面激活突觸前膜P2X3受體,促使谷氨酸釋放[8],通過NMDA和非NMDA系統(tǒng),介導(dǎo)疼痛信息。本研究旨在建立糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型,探討P2X3受體在其疾病發(fā)展過程中的作用,為臨床治療提供依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的制備及分組

        健康成年雄性SD大鼠,體重180~220 g,將其隨機(jī)分為造模組(n=30)和對照組(n=10),造模組按照不同時間點(diǎn)分為造模1周組、造模2周組、造模4周組,每組10只;應(yīng)用國際通用的鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ,Sigma公司)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型[9]。大鼠禁食水12 h后,腹腔一次性按照60 mg/kg劑量注射STZ,于注射后48 h,測量尾靜脈空腹血糖,如果血糖濃度>16.7 mmol/L,認(rèn)為造模成功。對照組僅注射相同劑量蒸餾水。

        1.2 血糖和體重測定

        造模48 h后,應(yīng)用血糖儀對所有大鼠進(jìn)行尾靜脈空腹血糖測定;于造模前及造模后1、2、4周進(jìn)行體重測定。

        1.3 痛行為學(xué)觀察

        于造模前和造模后1、2、4周對大鼠進(jìn)行機(jī)械痛閾值的測定。固定時間點(diǎn)(上午10:00~12:00),在固定的地點(diǎn),室內(nèi)環(huán)境盡可能安靜舒適(室溫維持在23℃左右,濕度55%左右)的情況下,給予人為機(jī)械刺激,觀察大鼠的痛行為改變。主要采用von Frey細(xì)絲法,不同規(guī)格的von Frey細(xì)絲(0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、1.0 g)垂直刺激大鼠后足足心處,持續(xù)5~10 s,出現(xiàn)明顯縮足、舔足或抬足行為均視為陽性反應(yīng)。刺激強(qiáng)度從弱到強(qiáng),重復(fù)10次,每間隔3~5 min一次,10次中有6次以上陽性反應(yīng)的最小刺激強(qiáng)度視為機(jī)械性痛閾值。

        1.4 Real-time觀察P2X3受體蛋白表達(dá)

        隨機(jī)取不同組5只SD大鼠,乙醚麻醉后,獲取L4~6 DRG神經(jīng)元,置于冰上放置的玻璃研磨器中,加入1 ml的Trizol(Gibico公司),迅速研磨至無肉眼可見組織塊。5 min后將各組裂解液吸到1.5 ml RNase EP管中,加入氯仿0.2 ml/管,劇烈振搖15 s,靜置2~5 min。4℃,12 000 r/min,離心10 min。離心后液體分為三層(上層——無色水樣層為RNA,中層白色為蛋白質(zhì)),小心吸取上層無色液體移入一個新的RNase EP管中,加入等體積異丙醇,上下顛倒混勻,靜置10~30 min,離心(4℃,12 000 r/min,10 min)。棄去上清,沉淀加入冰冷75%乙醇1 ml,漂洗,用移液搶吸取液體,干燥10~20 min,加入20 μl DEPC水溶解,分裝,-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,RT及PCR反應(yīng)體系(Promega公司)按試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Real-time實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)基因的CT值通過GAPDH的CT值均一化,即ΔCT=CT目標(biāo)-CTGAPDH,而目標(biāo)基因mRNA相對豐度值以ΔΔCT值(DD value)表示,ΔΔCT=2-ΔCT。

        P2X3引物序列為F:5′-CAACTTCAGGTTTGCCAA-3′;R:5′-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3′。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以x±s表示,采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 觀察

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