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RAD18基因rs373572位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性研究*

顧竹君#王紅&劉超樂(lè)貽軍林云安王文佳

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科廣州消化疾病中心(510180)

*基金項(xiàng)目：2012 年廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2060404)

#Email: 448197586@qq.com

背景：RAD18是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，在維持受損DNA的完整性和細(xì)胞基因組穩(wěn)定等方面起有重要作用。目的：研究RAD18基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)Arg302Gln(rs373572)與結(jié)直腸癌易感性及其臨床病理特征的關(guān)系。方法：提取109例結(jié)直腸癌患者和241名健康對(duì)照者的外周血基因組DNA，采用PCR測(cè)序法對(duì)RAD18基因rs373572位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。結(jié)果：結(jié)直腸癌組與對(duì)照組間RAD18基因rs373572位點(diǎn)GG、GA、AA基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)直腸癌組AA基因型頻率顯著高于對(duì)照組(16.5%對(duì)8.7%,P<0.05；校正后OR=2.428, 95% CI: 1.170~5.035)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者GA基因型頻率顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者(75.0%對(duì)41.9%,P<0.05；校正后OR=7.764, 95% CI: 0.927~65.206)。rs373572位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌分化程度、腫瘤部位、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：RAD18基因rs373572位點(diǎn)AA基因型可能是結(jié)直腸癌的遺傳易感因素，且該位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。

關(guān)鍵詞結(jié)直腸腫瘤；基因，RAD18；多態(tài)性，單核苷酸；腫瘤轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌是一種多因素相互作用的復(fù)雜疾病，可能的發(fā)病因素包括遺傳、環(huán)境、生活方式等。RAD18作為一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，在維持受損DNA的完整性和細(xì)胞基因組穩(wěn)定等方面起有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)RAD18參與了多條DNA修復(fù)通路，如復(fù)制后修復(fù)(postreplication repair, PRR)[1]、同源重組(homologous recombination, HR)[2]、Fanconi貧血癥(Fanconi anemia, FA)通路[3]等，而這些通路作為維持細(xì)胞正常增殖、分化、存活、凋亡的重要機(jī)制，與腫瘤形成密切相關(guān)。本研究旨在探討RAD18編碼基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點(diǎn)Arg302Gln(rs373572)與結(jié)直腸癌易感性及其臨床病理特征的關(guān)系，為闡明結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及結(jié)直腸癌高危人群的篩查、有效藥物靶點(diǎn)的篩選等提供依據(jù)。

材料與方法

一、研究對(duì)象

收集2010年3月—2014年11月廣州市第一人民醫(yī)院收治的病理學(xué)確診結(jié)直腸癌患者109例，患者年齡29~86歲，平均(64.95±12.10)歲，入組前均未接受過(guò)化療或放療。同期收集來(lái)自廣東省內(nèi)、體檢結(jié)果正常的健康人241名作為對(duì)照組，對(duì)照者年齡24~85歲，平均(60.50±15.03)歲，無(wú)腫瘤病史。研究方案通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，入組受檢者均知情同意。

二、方法

1. 基因組DNA提取：以EDTA-Na2抗凝管采集受檢者外周靜脈血2 mL，-80 ℃保存待測(cè)。按基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取基因組DNA。

2. RAD18基因rs373572位點(diǎn)基因分型：采用PCR測(cè)序法。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類基因DNA序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。引物序列：F 5’-ATA CCC ATC ACCCAT CTT C-3’，R 5’-CTG AAA TAG CCC ATTAAC ATA CA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物 205 bp。反應(yīng)體系總體積25 μL，內(nèi)含PCR mix(Takara Bio Company)12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板0.5 μL(約20 ng，可根據(jù)提取的DNA濃度調(diào)整)，以滅菌水補(bǔ)足體積。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，計(jì)算各基因型和等位基因頻率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)結(jié)直腸癌組和對(duì)照組分別行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，計(jì)算基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)程度的OR值及其95% CI，并以性別、年齡、吸煙史、家族史進(jìn)行校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、一般情況

結(jié)直腸癌組和對(duì)照組樣本分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，表明抽樣具有代表性。結(jié)直腸癌組性別、年齡、吸煙史與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但一級(jí)親屬有消化道腫瘤家族史者的比率顯著高于對(duì)照組(9.2%對(duì)3.7%,P=0.038)(表1)，提示家族史為結(jié)直腸癌危險(xiǎn)因素，統(tǒng)計(jì)分析時(shí)應(yīng)去除此混雜因素的影響。

表1　結(jié)直腸癌組與對(duì)照組一般情況比較 n(%)

二、RAD18基因rs373572位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

所有樣本均以直接測(cè)序進(jìn)行基因分型，從測(cè)序峰值圖上讀出基因型，純合子峰為單峰，雜合子峰為雙峰。經(jīng)檢測(cè)，RAD18基因rs373572位點(diǎn)純合子基因型為GG和AA，雜合子基因型為GA(圖1)。

圖1　RAD18基因rs373572位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

三、RAD18基因rs373572位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

結(jié)直腸癌組與對(duì)照組間RAD18基因rs373572位點(diǎn)GG、GA、AA基因型分布和G、A等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)直腸癌組AA基因型和A等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組，經(jīng)校正后OR值分別為2.428(95% CI: 1.170~5.035)和1.533(95% CI: 1.096~2.144)(表2)。

表2RAD18基因rs373572位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系n(%)

rs373572 位點(diǎn)結(jié)直腸癌組(n=109)對(duì)照組(n=241)P值OR(95%CI)基因型 GG40(36.7)118(49.0)1(參考值) GA51(46.8)102(42.3)0.1251.470(0.898~2.405) AA18(16.5)21(8.7)0.0172.428(1.170~5.035)等位基因 G131(60.1)338(70.1)1(參考值) A87(39.9)144(29.9)0.0121.533(1.096~2.144)

注：OR值經(jīng)性別、年齡、吸煙史、消化道腫瘤家族史校正

四、RAD18基因rs373572位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌患者中，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者間RAD18基因rs373572位點(diǎn)GG、GA、AA基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者GA基因型頻率為75.0%(12/16)，顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的41.9%(39/93)，經(jīng)校正后OR值為7.764(95% CI: 0.927~65.206)。rs373572位點(diǎn)各基因型分布與結(jié)直腸癌分化程度、腫瘤部位、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)(表3)。

討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，腫瘤的發(fā)生是具有遺傳易感性的個(gè)體受有害環(huán)境因素作用所致，包括SNPs在內(nèi)的遺傳變異是決定個(gè)體對(duì)腫瘤易感性的重要因素，如DNA修復(fù)基因多態(tài)性可影響DNA修復(fù)能力，進(jìn)而影響惡性腫瘤發(fā)病[4]。RAD18為一包含RING結(jié)構(gòu)、能與單鏈DNA結(jié)合、具有E3泛素連接酶活性的蛋白，可使多種DNA復(fù)制和修復(fù)通路的關(guān)鍵蛋白泛素化，目前發(fā)現(xiàn)其可能參與了PRR、HR、FA等多條DNA修復(fù)通路。如受損DNA在真核細(xì)胞進(jìn)入DNA合成的S期前仍未得到修復(fù)，系統(tǒng)將啟動(dòng)PRR通路以順利完成DNA復(fù)制，這一過(guò)程的開(kāi)啟主要是由增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的泛素化所調(diào)控，PCNA經(jīng)RAD6-RAD18這一E2-E3泛素連接酶復(fù)合物催化發(fā)生單泛素化后，招募一系列非特異性DNA合成酶至DNA損傷位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)DNA損傷后的DNA合成[5]，因此RAD18在DNA修復(fù)PRR通路中的作用備受關(guān)注。研究[6]證實(shí)，提取自人類細(xì)胞的RAD6和RAD18蛋白能使PCNA泛素化，上調(diào)或下調(diào)兩者表達(dá)可致PCNA的泛素化程度相應(yīng)升高或降低。此外，本課題小組既往研究還發(fā)現(xiàn)RAD18與FA通路關(guān)鍵蛋白FANCD2之間存在關(guān)聯(lián)，可能通過(guò)對(duì)FANCD2的泛素化調(diào)控FA通路功能，從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。

表3　RAD18基因rs373572位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

注：OR值經(jīng)性別、年齡、吸煙史、消化道腫瘤家族史校正

RAD18蛋白編碼基因位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)5帶(3p25.3)，Arg302Gln(rs373572)位點(diǎn)位于RAD18的核心功能——E3泛素連接酶編碼區(qū)，故該位點(diǎn)多態(tài)性可通過(guò)影響RAD18功能而影響其介導(dǎo)的多個(gè)DNA復(fù)制和修復(fù)通路。Kanzaki等[9-10]采用PCR-CTPP(confronting two-pair primer)法對(duì)日本人群的RAD18基因rs373572位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)AA基因型是結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌的危險(xiǎn)因素，國(guó)內(nèi)則尚未見(jiàn)RAD18基因SNPs與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用較PCR-CTPP法更權(quán)威、準(zhǔn)確、快速的直接測(cè)序法對(duì)結(jié)直腸癌患者和健康對(duì)照者的RAD18基因rs373572位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組AA基因型頻率顯著高于對(duì)照組(16.5%對(duì)8.7%,P<0.05; 校正后OR=2.428, 95% CI: 1.170~5.035)，表明攜帶AA基因型的個(gè)體患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增高，與Kanzaki等[9]對(duì)日本人群的研究結(jié)果相符。然而本研究中對(duì)照組的GG、GA、AA基因型頻率分別為49.0%、42.3%和8.7%，與Kanzaki等[9]報(bào)道的43%、45%和11%略有差異，考慮可能與研究人群不同有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者rs373572位點(diǎn)GA基因型頻率顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者(75.0%對(duì)41.9%,P<0.05; 校正后OR=7.764, 95% CI: 0.927~65.206)，表明攜帶GA基因型的結(jié)直腸癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增高。本研究未發(fā)現(xiàn)rs373572位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌分化程度、腫瘤部位、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在關(guān)聯(lián)，但其他文獻(xiàn)報(bào)道該位點(diǎn)多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，A等位基因頻率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中顯著升高，考慮此位點(diǎn)多態(tài)性可能與結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移有關(guān)[9]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示RAD18基因rs373572位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性以及腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，AA基因型可能是結(jié)直腸癌的遺傳易感因素。然而結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展為一涉及多基因突變的復(fù)雜的多步驟過(guò)程，單一位點(diǎn)多態(tài)性并不提示絕對(duì)致病性，且本研究樣本量偏小、樣本來(lái)源單一，后續(xù)擬擴(kuò)大樣本量、豐富樣本來(lái)源，聯(lián)合進(jìn)行多基因、多位點(diǎn)檢測(cè)，以進(jìn)一步明確RAD18基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的關(guān)系，同時(shí)以免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法等技術(shù)驗(yàn)證RAD18蛋白表達(dá)和功能與rs373572位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)聯(lián)，為從基因水平揭示結(jié)直腸癌的致病機(jī)制提供依據(jù)。

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(2015-04-09收稿；2015-05-04修回)·短篇論著·

Correlation of RAD18 Gene rs373572 Polymorphism with Colorectal CancerGUZhujun,WANGHong,LIUChao,LEYijun,LINYunan,WANGWenjia.DepartmentofGastroenterology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity;GuangzhouDigestiveDiseaseCenter,Guangzhou(510180)

Correspondence to: WANG Hong, Email: wong.hong@163.com

Background: RAD18 is a single stranded DNA binding protein, which plays an important role in maintaining the integrity of damaged DNA and the genomic stability of cells. Aims: To study the correlation of Arg302Gln (rs373572), a single nucleotide polymorphism (SNP) in RAD18 gene, with the susceptibility and clinicopathological features of colorectal cancer (CRC). Methods: Peripheral blood genomic DNA of 109 CRC patients and 241 healthy subjects were extracted and went through gene sequencing after PCR amplification for RAD18 rs373572 genotyping. Results: Statistically significant differences were found in distribution of RAD18 rs373572 GG, GA and AA genotypes between CRC and control groups (P<0.05); the frequency of AA genotype in CRC group was significantly higher than that in control group (16.5%vs. 8.7%,P<0.05; adjusted OR=2.428, 95% CI: 1.170-5.035).In CRC group, GA genotype was more frequent in patients with distant metastasis than those without (75.0%vs. 41.9%,P<0.05; adjusted OR=7.764, 95% CI: 0.927-65.206). No correlation was found between rs373572 polymorphism and differentiation, location, Duke’s stage and lymph node metastasis of CRC (P>0.05). Conclusions: RAD18 rs373572 AA genotype might be a genetic susceptible factor for CRC, and rs373572 polymorphism is correlated with distant metastasis of CRC.

Key wordsColorectal Neoplasms;Genes, RAD18;Polymorphism, Single Nucleotide;Neoplasm Metastasis

通信作者&本文，Email: wong.hong@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.12.007