薛士鵬

免疫微球檢測(cè)金黃色葡萄球菌與鏈球菌研究

薛士鵬

目的 研究金黃色葡萄球菌與鏈球菌的檢測(cè)方法。方法 制備三種免疫磁性微球作為載體, 利用存在于金黃色葡萄球菌表面的A蛋白、存在于G群鏈球菌表面的G蛋白、免疫球蛋白G(IgG)分子特異性結(jié)合的相關(guān)原理對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 三種免疫磁性微球均可有效地捕捉到G群鏈球菌、金黃色葡萄球菌。結(jié)論 應(yīng)用免疫微球?qū)瘘S色葡萄球菌、鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)具有良好的穩(wěn)定性, 在微生物檢測(cè)及臨床檢驗(yàn)過程中可推廣應(yīng)用。

免疫磁性微球；病原菌；檢測(cè)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)和G群鏈球菌(GGS)是極具代表性的醫(yī)源性感染及群發(fā)性感染病原菌［1］。金黃葡萄球菌(簡(jiǎn)稱金葡菌)是一種可引起人和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌,也是常見的食源性致病菌。該菌廣泛分布于空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中, 食品較易受其污染［2］。臨床中應(yīng)用的傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)方法操作復(fù)雜, 檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng), 速度較慢, 已經(jīng)無法適應(yīng)臨床快速診斷及治療需要［2］。本次研究主要對(duì)金黃色葡萄球菌與鏈球菌的免疫微球檢測(cè)情況進(jìn)行分析, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本次研究所應(yīng)用到的主要材料及試劑：人IgG、小牛血清、羊抗鼠IgG、表面帶醛基磁性微球、表面帶氨基磁性微球、金屬螯合磁性微球、乙醛-右旋糖苷等。

1.2 方法 ①磁性微球的免疫化。用高碘酸鈉將人IgG分子氧化后保存與磷酸鹽緩沖液中。分別人IgG融入3種存在不同基團(tuán)的磁性微球中, 在4℃的溫度下保存1晚。應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行3次清洗, 應(yīng)用雙蒸水(ddH2O)對(duì)微球進(jìn)行充分洗滌, 然后放置備用。②乙醛-右旋糖苷的包被。將乙醛-右旋糖苷融入到懸浮有醛基免疫磁性微球的pH=7.6中, 在室溫環(huán)境中進(jìn)行振蕩培養(yǎng), 培養(yǎng)時(shí)間為12 h。將固態(tài)形式的硼氫化鈉加入到pH=10中, 讓其方式持續(xù)性反應(yīng)2 h, 然后使用PBS進(jìn)行洗滌。應(yīng)用ddH2O進(jìn)行洗滌, 將已經(jīng)磁性微球所吸收的相關(guān)右旋糖苷除去。③免疫磁性微球承載人IgG分子能力。分別應(yīng)用不同量的人IgG分別加入到2 ml三種免疫磁性微球的PBS中, 在4℃的溫度下進(jìn)行1晚孵育。應(yīng)用ddH2O進(jìn)行充分洗滌, 然后使用Bradford方法對(duì)免疫磁性微球固定蛋白量進(jìn)行檢測(cè)。④不同磁性微球固定化人IgG分子速率。將人IgG分子(10 mg)分別添加到3種磁性微球中, 應(yīng)用Bradford方法對(duì)存在于上清液中的蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè), 檢測(cè)頻率為30 min檢測(cè)1次。⑤親和捕捉病原菌實(shí)驗(yàn)。將0.95 ml G族鏈球菌、0.95 ml金黃色葡萄球菌、0.95 ml大腸桿菌混合而成的混合物分別溶于0.1 ml三種免疫磁性微球, 在室溫狀態(tài)下進(jìn)行孵育。孵育的時(shí)間分別為10 min、20 min、1 h、2 h。然后進(jìn)行磁場(chǎng)分離操作, 將混合物取出, 并將其清涂于平板之上。在37℃的溫度下進(jìn)行1晚培養(yǎng), 對(duì)菌落形成單位進(jìn)行詳細(xì)記錄。⑥親和捕捉病原菌的免疫印記分析。將3種免疫化磁性微球(1 ml)分別溶入G群鏈球菌(9 ml)、金黃色葡萄球菌(9 ml)當(dāng)中, 在37℃的溫度下進(jìn)行孵育, 孵育的時(shí)間為1 h。然后將一定量的溶菌酶加入,同樣在37℃的溫度下進(jìn)行孵育, 孵育的時(shí)間為30 min, 然后進(jìn)行磁場(chǎng)分離操作, 將研究所用樣品進(jìn)行15 min的煮沸。煮沸過后裝上清20 μl取出, 實(shí)施下一步的蛋白電泳分離操作。電泳分離操作完畢后會(huì)形成兩塊凝膠, 對(duì)其中一塊凝膠進(jìn)行染色、脫色相關(guān)處理, 應(yīng)用免疫印記對(duì)另一塊上存在的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 不同磁性微球固定化人IgG分子速率情況 3種磁性微球?qū)gG進(jìn)行固定化的速率均各不相同。醛基磁性微球與氨基磁性微球的固定化速率存在較小差異。在金屬螯合磁性微球中, 其固定化速率表現(xiàn)為前30 min明顯較快, 30 min后明顯下降。

2.2 各微球表面固定人IgG分子的SDS-PAGE檢測(cè)情況通過對(duì)上清樣品實(shí)施SDS-PAGE分析操作后發(fā)現(xiàn), 各磁性微球的IgG分子裝載能力各不相同, 但當(dāng)同時(shí)給予磁性微球各10 mg人IgG分子時(shí), IgG分子均全部被固定于相應(yīng)磁性微球表面。

2.3 不同免疫磁性微球親和捕捉病原菌效果及親和捕捉病原菌的免疫印記實(shí)驗(yàn)效果 3種免疫化磁性微球都可在較短的時(shí)間有效地對(duì)病原菌進(jìn)行捕捉和分離, 醛基免疫化磁性微球的捕捉和分離的效率最佳。3種免疫磁性微球均可有效對(duì)G群鏈球菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行捕捉。

3 討論

臨床診斷及檢查過程中所用的金黃色葡萄球菌、G群鏈球菌的鑒定、檢測(cè)和分離方法存在操作復(fù)雜、應(yīng)用成本高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等諸多局限性［3］。因此加強(qiáng)對(duì)金黃色葡萄球菌、G群鏈球菌有效檢測(cè)方法進(jìn)行深入研究成為一個(gè)熱門課題,對(duì)臨床診斷技術(shù)的提高具有重要意義［4］。在本次研究中, 主要應(yīng)用捕捉病原菌的方法和分離病原菌方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)黃色葡萄球菌和鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果顯示, 應(yīng)用該種方法有效提高了操作的簡(jiǎn)便性, 大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。本次研究中所用的方法體系可通過樣品孵育, 然后再進(jìn)行磁場(chǎng)分離兩個(gè)步驟, 在短短的1 h之內(nèi)便可將分離出來的G群鏈球菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定, 大大提高了病原微生物的檢測(cè)效率和質(zhì)量。若通過在磁珠的表面接上不相同的各種抗體, 可實(shí)現(xiàn)將其他細(xì)胞、蛋白進(jìn)行分離。

綜上所述, 金黃色葡萄球菌普遍存在, 是院內(nèi)感染及食物中毒的主要病菌之一, 致病力強(qiáng), 對(duì)人體健康危害大。因此需加強(qiáng)金葡菌致病機(jī)理的研究, 并研制科學(xué)有效的快速檢測(cè)方法, 促進(jìn)其檢測(cè)效率得到有效提高, 具有重要的臨床意義。

［1］ 劉琳琳.免疫微球檢測(cè)金黃色葡萄球菌與鏈球菌研究.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué), 2008, 8(2):193-195.

［2］ 薛力剛, 劉金華, 王全凱, 等.金黃葡萄球菌核酸探針檢測(cè)方法的建立.中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2012, 11(8):215-216.

［3］ 陳清, 王雅賢, 俞守義.膠體金免疫層析法檢測(cè)金黃色葡萄球菌的初步研究.熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 12(12):372-373.

［4］ 鈕博, 王敏.金黃色葡萄球菌抗體的檢測(cè)與臨床意義.淮海醫(yī)藥, 2012, 8(35):188-199.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.21.205

2015-02-02］

473061 南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校