蘭艷麗，劉　韻

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院婦產科，湖北 襄陽　441021)

?

光動力學處理對宮頸癌細胞的miRNA的影響

蘭艷麗，劉韻

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院婦產科，湖北 襄陽441021)

摘要：目的研究光動力學(PDT)處理對宮頸癌細胞的miRNA的影響。方法 將HeLa細胞接種到黑色透明底的96孔微Optilux板(1×10 4細胞/孔)。24 h后，當細胞附著在培養(yǎng)板上，除去培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH 7.4)中洗滌3次，進行不同濃度的光敏劑PDT處理。評價PDT對HeLa細胞活力影響，并進行細胞計數，以評估其對PDT靈敏度。激光照射1 h后，所有HeLa細胞的總細胞RNA經Quick Gene RNA細胞培養(yǎng)試劑盒提取后，進行DNA酶處理，使用大容量cDNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄(RT)。實時PCR定量測定凋亡相關的miRNA(MIR-7，miR-148a，miR-204，miR-210，miR-216和miR-296的表達水平。結果 PDT處理1 h后，與未做任何干預處理的對照組比較，HeLa細胞存活率顯著降低至78%。PDT處理24 h后，HeLa細胞全部死亡。此外，PDT處理1 h后，HeLa細胞內聚半胱天冬酶活性，顯著增高。另外，PDT處理1 h后，miR-210和miR-296的表達水平顯著高于對照組。然而，其他miRNA的表達水平包括miR-7，miR-148a，miR-204和miR-216與對照組無差異。結論 PDT處理宮頸癌細胞后，miRNA表達水平不同，miR-210和miR-296的表達水平最高，可以作為宮頸癌PDT療效的標記物。

關鍵詞：光動力療法；小分子RNA；細胞凋亡；HeLa細胞；5氨基乙酰丙酸

宮頸癌是世界上第二大常見婦女腫瘤，在發(fā)展中國家尤為常見，我國宮頸癌的發(fā)生率高居女性惡性腫瘤的第一位，是引起婦女癌癥相關死亡的重要原因。近年來我國宮頸癌發(fā)病率總體偏高，宮頸癌低齡化的趨勢十分顯著，嚴重威脅著廣大婦女的身心健康。其中腫瘤轉移是導致患者死亡的主要原因。宮頸癌早期可以發(fā)生轉移，轉移患者愈后不佳。目前宮頸癌常用的治療手段主要是手術、放療和化療等，這些方法創(chuàng)傷大，毒副反應重，而且可能剝奪年輕患者的生育功能。因此積極開展宮頸癌浸潤轉移機制的研究對于宮頸癌的防治具有重要的現(xiàn)實意義。近年來發(fā)展起來光動力療法是的一種新的腫瘤治療方法，該方法是通過光敏化反應直接作用達到殺傷腫瘤細胞的目的，是一種光化學技術，用于新血管形成相關的多種癌癥和疾病的治療。該方法的其最大優(yōu)點在于對體內的腫瘤細胞高度的篩選選擇性并具有組織特異性，在殺傷腫瘤細胞情況的同時對健康組織的傷害及損傷達到最小。研究較熱門的小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼進行調控的單鏈RNA。目前幾年來，關于miRNA與子宮頸癌癥之前關系的研究已經成為了腫瘤研究熱點。光動力療法(PDT)miRNA是由基因編碼、轉錄成單個或群集的初級轉錄子，隨后產生成熟miRNA。人類癌癥細胞的變化與miRNA表達相關。據最新報道，miRNA的表達模式因腫瘤類型的不同而不同，并且miRNA表達譜反映了腫瘤的發(fā)育譜系和分化狀態(tài)[1]。大量的研究表明，該小分子物質miRNA在細胞增殖、凋亡表現(xiàn)出及腫瘤形成等方面具有廣泛而精確地調控蛋白質分解以及合成的重要作用。miRNA的異常表達可表現(xiàn)出被認為與宮頸癌癥的發(fā)生與發(fā)展具有密切的相關性。光動力學是宮頸癌癥的有效方法已經被證實，因此，更好地理解PDT治療腫瘤細胞的機制，將有助于設計新的干預措施和改善患者的長期生存情況。在這項研究中，重點研究PDT處理HeLa細胞后癌細胞內miRNA的變化。本課題通過篩選以及篩查對宮頸癌癥光動力學治療前及治療之后差異性表達的miRNA，旨在為差異miRNA對疾病的預測以及預后判斷，且為功能分析提供前提以及基礎。

1資料和方法

1.1資料光敏劑5-ALA(5氨基乙酰丙酸)購自美國Sigma公司。宮頸癌細胞系Hela由中國醫(yī)學科學院，中國協(xié)和醫(yī)科大學北京協(xié)和醫(yī)院婦科腫瘤實驗室提供。連續(xù)波半導體激光發(fā)生器用于激發(fā)光敏劑(664±1)nm波長(JENOPTIK公司，德國)。

1.2細胞培養(yǎng)物，光敏劑，PDTHeLa細胞接種到黑色透明底96孔的微Optilux板(BD生物科學公司，加利福尼亞州)(1×104細胞/孔)。24 h后，當細胞附著在培養(yǎng)板上，除去培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH 7.4)中洗滌3次，進行PDT處理。簡言之，光敏劑ALA：分子量167.6，使用前藥物用PBS配成25 mmol·L-1，5 mol·L-1NaOH 調pH值至7.0，濾過除菌，避光保存。細胞經由連接于培養(yǎng)板底部的光纖進行激光照射。激光照射后，將培養(yǎng)基替換為完全生長基。試劑：Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國Invitroge公司)，蛋白酶 K( 默克生物公司)，TaqMix(東盛生物公司)，PCR試劑盒、TaqMan miRNA試劑盒(美國Santa Cruz公司)，RNA提取試劑盒采用(美國Sigma)，DEPC(上海碧云天生物)，乙醇、異丙醇、氯仿(上海碩盟生物)。

儀器：高速冷凍離心機(德國BiofugeStratos)，-8～4℃冰箱(日本松下)， PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)，紫外分光光度儀(Beckman Coulter 公司)。

1.3HeLa細胞的PDT療效評價評價PDT對HeLa細胞活力的影響，并進行細胞計數，以評估其對PDT的靈敏度。細胞計數板、蓋玻片用70%酒精擦凈，將蓋玻片蓋于血球計數板的計數室上，常規(guī)消化細胞，吹打成均勻的細胞懸液，用吸管吸一滴細胞懸液，由蓋玻片邊緣加入，計數室的四角的四個大 方格的細胞數(又各劃分為16個中方格)。壓線的只計上線和左側，按下式計數：細胞數/mL= PDT誘導的細胞凋亡評價， 采用FLICA聚半胱天冬檢測方法測量蛋白酶活性水平。

1.4RNA提取和實時PCR 激光照射1 h后，所有HeLa細胞的總細胞RNA經Quick Gene RNA細胞培養(yǎng)試劑盒提取。所有樣品進行DNA酶處理，以避免DNA污染，接著使用大容量cDNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄(RT)。采用RNA提取試劑盒進行RNA提取，采用TaqMan miRNA試劑盒檢測MicroRNA的相對表達量。采用RNU6作為內參進行校正。對MicroRNA的表達水平采用二步法進行檢測，第一步是通過莖環(huán)引物來合成互補DNA，再通過miRNA的逆轉錄系統(tǒng)對10 ng RNA進行逆轉了反應體系進行反應，在PCR管加入10 μL的逆轉錄緩沖液，總的RNA濃度調整到2 μg·L-1，最后加入5 μL的逆轉錄引物，在冰上混勻之后反應5 min，接著進行梯度變性反應，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減，第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應體系，反應體系為2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman miRNA的特異性引物(MicroRNA：上游5'-caca guaggc cuca aauguuuguuga uga-3'，下游5'-gugu cguccg gggu uuacagacaacu acu-3')，通過逆轉錄體系進行反應，cDNA共5 μL加入到RNA的去酶的水當中，將體積擴增至20 μL，通過循環(huán)反應94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減的擴張40個循環(huán)之后，對實驗結果進行分析，采用熒光實時定量反應，按照PCR操作說明，Ct的檢測值應當在20～32之外的需要進行第二次檢測。應用△Ct=Ct microRNA-CtRNU6的計算公式計算microRNA的相對表達量。測定凋亡相關的miRNA(miR-7，miR-148a，miR-204，miR-210，miR-216和miR-296的表達水平。

2結果

2.1HeLa細胞的PDT療效PDT處理1 h后，與未做干預處理的相比對照組，HeLa細胞存活率顯著降低至78%。PDT處理24 h后，HeLa細胞全部死亡。此外，PDT處理1 h后，HeLa細胞內聚半胱天冬酶活性，顯著增高。細胞存活率與PDT誘導細胞凋亡的結果，見表1。這些結果表明，PDT處理宮頸癌后，癌細胞凋亡將立即啟動。

表1 不同處理對HeLa細胞存活率及凋亡的影響

注：光敏劑濃度0mg·L-1為對照組。

2.2PDT處理后癌細胞的miRNA表達情況PDT處理1 h后，miR-210和miR-296的表達水平顯著高于對照組，然而，其他miRNA的表達水平包括miR-7，miR-148a，miR-204和miR-216與對照組無差異。見圖1和圖2。

3討論

宮頸癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤，是引起婦女癌癥死亡的主要原因。近年來我國宮頸癌發(fā)病率總體偏高，每年新發(fā)病例近13萬，接近于發(fā)達國家的6倍，宮頸癌低齡化的趨勢也十分顯著，嚴重威脅著廣大婦女的身心健康[2]。宮頸癌早期腫瘤組織發(fā)生轉移，導致患者術后治愈效果不佳，是導致患者死亡的主要原因。通過對宮頸癌光動力學治療前后差異表達microRNA的研究，可以更好的發(fā)現(xiàn)其發(fā)生機制并為相關研究提供新思路，同時也可以為新的治療方法和提早預防提供新方向[3]。希望本研究中的研究思路和結論對今后更深入機制研究提供新的思路，同時也希望本研究為治療宮頸癌光動力學治療提供新的靶點。光動力療法是近年來發(fā)展起來的一種較新腫瘤治療方法，是通過光敏化反應達到殺傷腫瘤細胞的目的，其最大優(yōu)點在于對腫瘤細胞高度的選擇性和組織特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時對健康組織的損傷達到最小[4-5]。目前，PDT已經被批準用于治療局部疾病和癌前病變，如子宮頸癌，膀胱癌，垂體瘤，膠質母細胞瘤，同時作為姑息治療早期肺癌和食道癌及基底細胞癌的一種治療手段[6]。

目前正在進行的臨床研究目的是為了優(yōu)化PDT的條件。研究較熱門的小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼進行調控的單鏈RNA[7]。是一類能夠調節(jié)多種靶基因發(fā)揮生物學效應的重要分子，也是目前腫瘤分子機制的研究熱點內容[8]。miRNA作為新型的非編碼的單鏈RNA，其長度僅為22個核苷酸序列，但是該分子廣泛存在于各類生物的真核細胞當中，隨著生物信息學的發(fā)展，miRNA在腫瘤中的相關研究越來越深入，研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與者各類腫瘤的生長、發(fā)育，與腫瘤細胞的增殖凋亡以及侵襲轉移密切相關，涉及到各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且miRNAs的表達譜還決定著腫瘤的基因反省，在腫瘤亞型、轉移等臨床病理因素中發(fā)揮著重要作用，尤其對于術后的生存期及預后具有一定的相關性，研究提示了miRNA可以用于對腫瘤預后的評估，其表達量與腫瘤的預后有著一定的相關性[9-10]。關于miRNA與子宮頸癌癥之前關系的研究已經成為了腫瘤研究熱點[11]。大量的研究表明，該小分子物質miRNA在細胞增殖、凋亡表現(xiàn)出及腫瘤形成等方面具有廣泛而精確地調控蛋白質分解以及合成的重要作者用[12]。本研究選用的microRNA表達譜芯片共篩選出170個與宮頸癌放化療敏感性相關的差異表達的microRNAs，治療抗拒組與敏感組相比表達顯著增高者144個，顯著降低者26個。選取兩組患者中統(tǒng)計學差異較為顯著，同時根據靶基因預測網站的預測分析，如預測發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體EGFR上有兩個miR-296的結合位點，并結合microRNA及其祀基因在其他腫瘤中的研究，如己有研究顯示miR-216作用于DNA-PKcs或ATM發(fā)揮作用，而DNA-PKcs和ATM是體內DNA雙鏈斷裂修復的兩種主要方式[13]。因此選取miR-7，miR-148a，miR-204，miR-210，miR-216和miR-296這6個microRNAs，作為區(qū)分敏感組和抗拒組的目標microRNAs。經進一步的hierarchical聚類分析，從聚類圖上可以直觀的看出在敏感組和抗拒組中這6個microRNA表達差異明顯，能夠將兩組很明顯的區(qū)分開來。因此將這6個microRNA進一步在小樣本中選用TaqMan Real-time PCR方法進行初步的驗證。雖然miR-886-3p、miR-125a-5p、miR-365和miR-489這4個microRNA未能在初步的驗證中顯示出差異，但是由于驗證的標本量較少，敏感組和抗拒組均只有10例患者，因此可能存在偏倚和不足，如果能擴大樣本量進行進一步的研究，可能會有更有說服力的結果。miR-101曾經在宮頸癌中被報道表達下降，但并沒有它與治療相關方面的研究[14]。了解這些microRNAs在其他腫瘤中的研究，包括表達、作用的靶基因和相關作用機制等，可能對其在宮頸癌治療敏感性相關中的研究得到一定的啟示。

miRNA的異常表達可表現(xiàn)出被認為與宮頸癌癥的發(fā)生與發(fā)展具有密切的相關性[15]。然而，除了細胞活力本身之外，評估細胞死亡和PDT療效，沒有其他標準化的生物標記物。已有研究通過高通量篩選技術的篩查出了與宮頸癌相關的MicroRNA，研究還提示了多指教MicroRNA基因的上調與宮頸癌的發(fā)生轉移有著密切的關系，但特定區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)可以使人更易罹患疾病[16]，已有研究提示MicroRNA-421的+60位點上存在著基因多態(tài)性位點，該位點存在在種子序列當中，可以調控該基因的成熟體，Cheng等[4]發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA-95，124，125，133，134，144，150，152，187，190，191，192，193，204，211，218，220，296和299會減緩癌細胞的生長，而抑制miR-21和的miR-24顯著促進HeLa細胞的生長。此外，他們發(fā)現(xiàn)miRNA(miR-7，148，204，210，216和296)促進癌細胞凋亡。這些數據表明，特定miRNA參與了細胞死亡應答過程。本課題通過實時PCR定量測定凋亡相關的miRNA(miR-7，miR-148a，miR-204，miR-210，miR-216和miR-296的表達水平，旨在為差異miRNA對疾病的預測以及預后判斷，且為功能分析提供前提以及基礎。

miR-210是缺氧條件刺激下，最多的miRNA。由于PDT固有的后果是缺氧和穩(wěn)定細胞內的HIF。本研究也觀察到miR-210的表達與其缺氧環(huán)境有關。已有報道HIF信號傳導途徑參與miR-210的調節(jié)。為了研究miR-210功能部分或完全喪失導致的生物學效應，他們還確定了miR-210的靶mRNA。根據該報告，miR-210作為一種重要的調節(jié)因子，參與基因轉錄，細胞代謝，分化和發(fā)育[17]。miR-210作為重要的細胞過程調節(jié)器，以及參與腫瘤基因高頻拷貝過程，可以推測miR-210參與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞缺氧及細胞周期調控之間存在潛在聯(lián)系。

研究報道m(xù)iR-296在促進腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用。他們發(fā)現(xiàn)，血管內皮生長因子單獨能夠增加miR-296的表達。此外該結果發(fā)現(xiàn)了一個有趣的反饋機制， VEGF誘導miR-296的表達，其靶點為肝細胞生長因子調控的酪氨酸激酶底物(HGS)，這反過來又導致血管內皮生長因子受體2和血小板衍生生長因子(PDGF)受體β蛋白水平的增加，最終提高血管內皮生長因子的生成[18]。PDT處理后的固有后果之一，就是腫瘤細胞的血管內皮生長因子的敏感性增加[19]，因此我們的研究結果表明，抑制miR-296的表達，阻礙反饋機制，減少VEGF，應該能夠改善PDT療效。

綜上所論， PDT導致缺氧，后者誘導miR-210的表達，隨后增加VEGF表達和miR-296的表達。因此，miR-210和miR-296的表達水平，可作為衡量PDT治療宮頸癌療效的生物標記物。

參考文獻：

[1]車萬民,董濤,趙全華,等.立體定向光動力療法治療惡性腦腫瘤[J].中華神經外科雜志,2013,29(7):724-726.

[2]許文偉,付俊武,闞文宏.缺氧誘導因子-1α對腫瘤調控機制的研究進展[J].廣東醫(yī)學,2012,32(22):3015-3017.

[3]羅紅敏, 胡森.膿毒癥患者缺氧誘導因子-1及其靶基因表達下降[J].中華危重病急救醫(yī)學,2013,25(4):210-210.

[4]Cheng AM,Byrom MW,Shelton J,et al.Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis[J].Nucleic Acids Research,2005,33(4):1290-1297.

[5]Giannakakis A,Sandaltzopoulos R,Greshock J,et al.miR-210 links hypoxia with cell cycle regulation and is deleted in human epithelial ovarian cancer[J].Cancer Biology & Therapy,2008,7(2):255-264.

[6]Ritchie W,Flamant S,Rasko JE.mimiRNA:a microRNA expression profiler and classification resource designed to identify functional correlations between microRNAs and their targets[J].Bioinformati cs,2010,26(2):223-227.

[7]Würdinger T,Tannous BA,Saydam O,et al.miR-296 regulates growth factor receptor overexpression in angiogenic endothelial cells[J].Cancer Cell,2008,14(5):382-393.

[8]Gomer CJ,Ferrario A,Luna M,et al.Photodynamic therapy:combined modality approaches targeting the tumor microenvironment[J].Lasers in Surgery and Medicine,2006,38(5):516-521.

[9]Gocze K,Gombos K,Juhasz K,et al.Unique microRNA expression profiles in cervical cancer[J].Anticancer Res,2013,33(6):2561-2567.

[10] Ouyang G,Wang Z,Fang X,et al.Molecular signaling of the epithelial to mesenchymal transition in generating and maintaining cancer stem cells[J].Cell Mol Life Sci,2010,67(15):2605-2618.

[11] Zhang Y,Li M,Wang H,et al.Profiling of 95 microRNAs in pancreatic cancer cell lines and surgical specimens by real-time PCR analysis[J].World J Surg,2009,33(4):698-709.

[12] Wu J,Li G,Yao Y,et al.MicroRNA-421 is a new potential diagnosis biomarker with higher sensitivity and specificity than carcinoembryonic antigen and cancer antigen 125 in gastric cancer[J].Biomarkers,2015,20(1):58-63.

[13] Siva AC,Nelson LJ,Fleischer CL,et al.Molecular assays for the detection of microRNAs in prostate cancer[J].Mol Cancer,2009,8:17-25.

[14] Ohashi S,Natsuizaka M,Naganuma S,et al.A NOTCH3-mediated squamous cell differentiation program limits expansion of EMT-competent cells that express the ZEB transcription factors[J].Cancer Res,2011,71(21):6836-6847.

[15] Jiang Z,Guo J,Xiao B,et al.Increased expression of miR-421 in human gastric carcinoma and its clinical association[J].J Gastroenterol,2010,45(1):17-23.

[16] Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

[17] Laurson J,Khan S,Chung R,et al.Epigenetic repression of E-cadherin by human papillomavirus 16 E7 protein[J].Carcinogenesis,2010,31(5):918-926.

[18] Khanamiryan L, Li Z,Paulin D,et al.Self-assembly incompetence of synemin is related to the property of its head and rod domains[J].Biochemistry,2008,47(36):9531-9539.

[19] Ning S,Ted WH,Denise P,et al.Synemin interacts with the LIM domain protein zyxin and is essential for cell adhesion and migration[J].Exp Cell Res,2010,316:491-505.

關于文稿中法定計量單位的書寫要求

本刊法定計量單位實行國務院1984年2月頒布的《中華人民共和國法定計量單位》，并以單位符號表示，具體使用參照1991年中華醫(yī)學會編輯出版部編輯的《法定計量單位在醫(yī)學上的應用》一書。注意單位名稱與單位符號不可混合使用，如ng·kg-1·天-1應改為ng·kg-1·min-1；組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時，應采用負數冪的形式表示，如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式；組合單位中斜線和負數冪亦不可混用，如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出現(xiàn)不常用的法定計量單位處用括號加注與舊制單位的換算系數，下文再出現(xiàn)時只列法定計量單位。人體及動物體內的壓力單位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出現(xiàn)時用括號加注(1 mmHg=0.133 kPa)。正文中時間的表達，凡前面帶有具體數據者應采用d、h、min、s，而不用天、小時、分鐘、秒。量的符號一律用斜體字母，如吸光度(舊稱光密度)的符號為A,“A”為斜體字。

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.020

通信作者：劉韻，女，副主任醫(yī)師，研究方向：婦產科疾病診斷與治療，E-mail:59210257@qq.com

(收稿日期：2015-05-04，修回日期：2015-07-09)

Photodynamic Treatment on miRNA in cancer cells

LAN Yan-li,LIU Yun

(XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiCollegeofArtsandSciences,Xiangyang,Hubei441021)

Abstract:Objective To study the photodynamic (PDT) effect on ervical cancer cells, miRNA expression.Methods HeLa cells were seeded into a black with clear bottom 96-well micro Optilux plates (BD Biosciences, CA) (1 × 104 cells / well).24 h later, when cells were attached to the culture plate, the medium was removed, and the cultures were washed 3 times in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4),PDT treatment with different concentrations of photosensitizer.HeLa cell viability evaluation PDT on impact, and cell count to assess their sensitivity for PDT.After laser irradiation 1 h, total cellular RNA of all HeLa cells Use Quick Gene RNA extraction cell culture kit.All DNA samples were enzymatically treated in order to avoid contamination of DNA, followed by the use of high capacity cDNA reverse transcription kit reverse transcription (RT).Apoptosis-related miRNA (miR-7, miR-148a, miR-204, miR-210, miR-216 and miR-296 expression levels were determined by quantitative real-time PCR.Results After PDT treatment 1h, compared with the control group without making any intervention treatment, HeLa cell viability was significantly reduced to 78%.24 hours after PDT treatment,HeLa cells all died. In addition, PDT poly caspase activity in HeLa cells within one hour after treatment, was significantly increased.In addition, the PDT treatment 1 h, miR-210 and miR-296 expression levels were significantly higher. However, the expression levels of other miRNA include miR-7, miR-148a, miR-204 and miR-216 no difference with the control group.

Conclusions Talaporfin sodium PDT photosensitizers treated as cervical cancer cells, distinct miRNA expression levels, the highest miR-210 and miR-296 expression levels can be used as markers of cervical cancer PDT efficacy thereof.

Key words:photodynamic therapy; small molecule RNA; apoptosis; HeLa cells; 5-ALA