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        高效液相色譜法測定那格列奈膠囊的有關(guān)物質(zhì)

        2015-02-01 03:42:58張翠蘭
        安徽醫(yī)藥 2015年12期

        張翠蘭

        (涿州市醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 涿州 072750)

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        高效液相色譜法測定那格列奈膠囊的有關(guān)物質(zhì)

        張翠蘭

        (涿州市醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北 涿州072750)

        摘要:目的建立高效液相色譜法測定那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)的方法。方法采用AlltimaTMC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以磷酸鹽緩沖液(pH=3.0)—乙腈為流動相進行梯度洗脫,流速為1.0 mL·min-1,柱溫為30℃,檢測波長為210 nm,進樣量為20 μL。結(jié)果高效液相色譜法測定有關(guān)物質(zhì)的線性范圍均為0.5~10.0 mg·L-1,相關(guān)系數(shù)均大于0.999(n=6)。結(jié)論該方法簡單、精確,有關(guān)物質(zhì)的分離度較好,可以作為那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)的測定方法。

        關(guān)鍵詞:那格列奈膠囊;有關(guān)物質(zhì);高效液相色譜法

        那格列奈膠囊的藥用活性成分為那格列奈,是一種臨床上應用于治療2型糖尿病的可以口服的處方藥[1-2]。那格列奈,其英文名為Nateglinide,CAS號為105816-04-4,化學名為N-(反式-4-異丙基環(huán)已基-1-甲?;?-D-苯丙氨酸,其主要是通過與胰島B細胞的磺酰脲受體結(jié)合,阻滯胰島細胞ATP敏感鉀通道開放,細胞膜去極化,從而引起鈣通道開放,促進胰島素的分泌,是一種新型的餐時血糖調(diào)節(jié)劑[3-4]。那格列奈膠囊能夠有效控制餐后的血糖水平,具有起效快、作用時間短,心血管副作用和低血糖發(fā)生率低等優(yōu)點,具有廣闊市場前景。通過研究那格列奈的合成工藝[5-7],查閱美國藥典[8]項下那格列奈知那格列奈主要存在以下4種有關(guān)物質(zhì),即:trans-4-Isopropylcyclohexylcarboxylic acid(有關(guān)物質(zhì)A)、N-(trans-4-Ethylcyclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine(有關(guān)物質(zhì)B)、N-(trans-4-Isopropylclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine-D-phenylalanine(有關(guān)物質(zhì)C)、N-(trans-4-isopropylcyclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine-ethyl ester(有關(guān)物質(zhì)D),本實驗建立了高效液相色譜法測定那格列奈膠囊中有關(guān)物質(zhì)的方法,為控制那格列奈膠囊的質(zhì)量提供了參考。

        1儀器與試劑

        Agilent 1260 Infinity LC色譜儀(Agilent technologies);色譜柱為AlltimaTM C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);PHS-3C酸度計(天津市賽得利實驗分析儀器有限公司);BT25S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,精密度為十萬分之一);TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);那格列奈對照品(購于TLC公司,純度99.9%,批號:tlc1403008);有關(guān)物質(zhì)A(購于TLC公司,純度99.3%,批號:tlc1407034);有關(guān)物質(zhì)B(購于TLC公司,純度99.6%,批號:tlc1405028);有關(guān)物質(zhì)C(購于TLC公司,純度99.2%,批號:tlc1409107);有關(guān)物質(zhì)D(購于TLC公司,純度99.6%,批號:tlc1404064);那格列奈膠囊(自制,批號:150109、150203、150402);參比那格列奈膠囊(海南海靈化學制藥有限公司,規(guī)格為每片30 mg,批號:141207);乙腈為色譜純;實驗用水為純化水,其他試劑均為分析純。

        2方法與結(jié)果

        2.1色譜條件色譜柱:AlltimaTMC18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測波長:210 nm;流速:1.0 mL·min-1;進樣體積:20 μL;柱溫:30℃。流動相A:0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(含1%磷酸),用三乙胺調(diào)節(jié)pH=3.0;流動相B:乙腈按照表1進行梯度洗脫。

        表1 乙腈洗脫梯度

        2.2溶液的制備

        2.2.1供試品溶液制備取那格列奈膠囊,除去膠囊外殼,將膠囊內(nèi)填充物研細,取適量細粉(約相當于那格列奈25 mg),精密稱量,置于25 mL容量瓶中,加入乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取5 mL,置于100 mL容量瓶中,加入流動相稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為那格列奈膠囊供試品溶液。

        2.2.2輔料溶液的制備取那格列奈膠囊中的各個輔料,按照制劑處方工藝中的輔料比例進行稱取,充分混合,精密稱量125 mg,置于25 mL容量瓶中,加入乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為那格列奈膠囊輔料溶液。

        2.2.3有關(guān)物質(zhì)對照品溶液的制備分別精密稱量有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D對照品各10 mg,分別置于100 mL容量瓶中,加入乙腈溶解并稀釋至刻度線,搖勻,得到有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的乙腈儲備液。精密量取有關(guān)物質(zhì)各儲備液2.0 mL,分別置于100 mL的容量瓶中,加入流動相稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D對照品溶液,溶液濃度均為2.0 mg·L-1。

        2.2.4混合溶液的制備精密量取“2.2.1”項下制備的供試品溶液和“2.2.3”項下制備的各有關(guān)物質(zhì)的對照品溶液,依次置于同一個50 mL容量瓶中,加入流動相稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為那格列奈和有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的混合溶液。

        2.3系統(tǒng)適應性實驗及專屬性實驗 按“2.1”項所述的色譜條件,依次準確量流動相、輔料溶液、混合溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。那格列奈及有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的保留時間如圖1~5中所示,那格列奈峰峰形良好,主峰與各雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5,各峰的理論塔板數(shù)均大于5 000,對稱因子均為1.0左右,對稱性良好;空白溶劑、輔料略有吸收,空白溶劑色譜圖中有微小的溶劑峰、梯度峰,與那格列奈及各有關(guān)物質(zhì)峰均不重合,可扣除,輔料色譜圖中出峰時間很早,可扣除,因而不會影響測定結(jié)果準確性,此方法專屬性較好。

        2.4精密度實驗取“2.2.3”項下的有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的對照品溶液,按“2.1”項下的色譜條件,精密量取20 μL,注入色譜儀,記錄色譜圖,連續(xù)操作進樣6次。有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的峰面積值RSD分別為0.75%、0.82%、0.93%、0.64%,結(jié)果說明儀器精密度良好。

        2.5線性關(guān)系實驗取“2.2.3”項所述的有關(guān)物質(zhì) A 的乙腈儲備液適量置于容量瓶中,加入流動相稀釋配成有關(guān)物質(zhì) A 濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L-1系列溶液,按“2.1”項所述的色譜條件,分別精密量取20 μL依次注入色譜儀,記錄色譜圖。

        以有關(guān)物質(zhì)的進樣濃度(C)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸,得到有關(guān)物質(zhì)A回歸方程為A=45.99C- 0.087 2,R= 0.999 58。

        依同樣方法得到有關(guān)物質(zhì)B的回歸方程為A=33.55C-0.40,R=0.999 46;

        有關(guān)物質(zhì)C的回歸方程為A=38.63C+0.36,R= 0.999 16;

        有關(guān)物質(zhì)D的回歸方程為A=45.17C-0.87,R= 0.999 53;

        以上結(jié)果表明,有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D在濃度范圍內(nèi)有關(guān)物質(zhì)的濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系,有關(guān)物質(zhì) A、B、C、D濃度的線性均為0.5~10.0 mg·L-1。

        2.6定量限與檢測限實驗量取“2.2.3”項下取有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D線性范圍內(nèi)的最低濃度逐漸稀釋,進樣,記錄色譜圖,取信噪比(S/N)為 10 的濃度為定量限濃度,信噪比(S/N)為 3 的濃度為檢測限濃度。測得有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果表2所示。

        表2 定量限與檢測限實驗結(jié)果

        2.7穩(wěn)定性實驗取“2.2.3”項下的有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的對照品溶液,濾過,精密量取續(xù)濾液各20 μL 分別于0、0.5、1.0、2.0 、4.0 、12 h 時進樣,記錄色譜圖,測得峰面積的RSD值分別為0.9%、1.1%、1.4%、0.8%。結(jié)果表明有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的溶液在12 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

        2.8加樣回收率實驗取那格列奈膠囊,研細,取細粉適量,精密稱定,按“2.2.1”項下的供試品溶液配制方法,配成濃度為150 mg·L-1的溶液,精密量取供試品溶液和有關(guān)物質(zhì)的對照品溶液適量,分別置于10 mL容 量瓶中,再向容量瓶中加入適量的有關(guān)物質(zhì)A,用流動相稀釋至刻度,搖勻,配制成有關(guān)物質(zhì)A的試驗供試品溶液,濾過,精密量取續(xù)濾液20 μL 分別注入色譜儀,記錄色譜圖。相應試驗平行制備3份,并進行相應的檢測。

        依同樣方法制備有關(guān)物質(zhì)B、C、D的供試品溶液,并進行檢測。按外標法以峰面積計算回收率,加樣回收率實驗結(jié)果見表3所示。由結(jié)果可知,在此色譜條件下各有關(guān)物質(zhì)的回收率良好。

        表3 加樣回收率實驗結(jié)果

        2.9那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)的檢測取自制那格列奈膠囊三批和購買的參比制劑,按“2.2.1”項下所述的供試品溶液制備方法,依次配制各批次供試品溶液和參比制劑對照品溶液。按“2.1”項所述的色譜條件,分別精密量取20 μL,依次注入色譜儀,記錄色譜圖,實驗測定結(jié)果如表4所示。實驗結(jié)果表明,自制三批那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)均小于0.1%,均未超過限度要求,與參比制劑有關(guān)物質(zhì)大體上一致或更優(yōu),符合中國藥典及申報的要求。

        表4 那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/%

        3討論

        3.1流動相pH值的選擇查閱相關(guān)文獻資料中相似的檢測方法[9-12],選用流動相pH=1.0進行等度洗脫,結(jié)果顯示理論塔板數(shù)雖較高,但有關(guān)物質(zhì)C、D的色譜峰拖尾嚴重,峰形不好,且有關(guān)物質(zhì)D與主峰的分離度較小,不能較好的分離。本實驗考察了流動相A調(diào)節(jié)為不同的pH值對色譜峰的影響,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)至pH=3.0時,峰形、分離度、塔板數(shù)均符合要求且比其他條件更優(yōu),故最終選擇此色譜條件。

        3.2檢測波長的選擇取那格列奈對照品,按“2.2. 3”項所述方法配制那格列奈對照品溶液,采用TU-1900紫外—可見分光光度計,于200~400 nm進行掃描,結(jié)果如圖6所示,那格列奈在210 nm、258 nm處均有較大吸收;將有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D對照品溶液于200~400 nm進行掃描 ,結(jié)果如圖7所示,有關(guān)物質(zhì)的最大吸收均在210 nm處,因此本實驗建立的色譜條件選擇210 nm作為檢測波長。

        綜上所述,本實驗所建立的高效液相色譜法測定那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)的方法,操作簡便,專屬性、適用性較強,分離度很好,適用于那格列奈膠囊中有關(guān)物質(zhì)的控制檢測,同時為那格列奈膠囊質(zhì)量體系的建立提供了參考,為那格列奈仿制藥的申請?zhí)峁┝艘罁?jù)。

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        doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.017

        (收稿日期:2015-04-18,修回日期:2015-06-07)

        Determination of the related substances in Nateglinide capsules by HPLC

        ZHANG Cui-lan

        (Department of Endocrinology, Zhuozhou Hospital,Zhuozhou072750,China)

        Abstract:Objective To control the related substances in Nateglinide capsules by HPLC. Methods Seperation was performed on an AlltimaTMC18column (250 mm×4.6 mm,5 μm). The mobile phase was a mixture of ammonium dihydrogen phosphate (pH=3.0) - acetonitrile with flow rate at 1.0 mL·min-1and the column temperature was 30℃. The detection wavelength was 210 nm and injection volume was 20 μL. Results There was a good linearity over the range of 0.5~10.0 mg·L-1with a correlation coefficient greater than 0.999(n=6). Conclusions This method is easy to operate, accurate and highly sensitive , which can be applied to control the related substances in Nateglinide capsules.

        Key words:Nateglinide capsules;related substance;HPLC

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