張翠蘭

(涿州市醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 涿州　072750)

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高效液相色譜法測定那格列奈膠囊的有關(guān)物質(zhì)

張翠蘭

(涿州市醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 涿州072750)

摘要：目的建立高效液相色譜法測定那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)的方法。方法采用AlltimaTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以磷酸鹽緩沖液(pH=3.0)—乙腈為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長為210 nm，進樣量為20 μL。結(jié)果高效液相色譜法測定有關(guān)物質(zhì)的線性范圍均為0.5～10.0 mg·L-1，相關(guān)系數(shù)均大于0.999(n=6)。結(jié)論該方法簡單、精確，有關(guān)物質(zhì)的分離度較好，可以作為那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)的測定方法。

關(guān)鍵詞：那格列奈膠囊；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法

那格列奈膠囊的藥用活性成分為那格列奈，是一種臨床上應用于治療2型糖尿病的可以口服的處方藥[1-2]。那格列奈，其英文名為Nateglinide，CAS號為105816-04-4，化學名為N-(反式-4-異丙基環(huán)已基-1-甲?；?-D-苯丙氨酸，其主要是通過與胰島B細胞的磺酰脲受體結(jié)合，阻滯胰島細胞ATP敏感鉀通道開放，細胞膜去極化，從而引起鈣通道開放，促進胰島素的分泌，是一種新型的餐時血糖調(diào)節(jié)劑[3-4]。那格列奈膠囊能夠有效控制餐后的血糖水平，具有起效快、作用時間短，心血管副作用和低血糖發(fā)生率低等優(yōu)點，具有廣闊市場前景。通過研究那格列奈的合成工藝[5-7]，查閱美國藥典[8]項下那格列奈知那格列奈主要存在以下4種有關(guān)物質(zhì)，即：trans-4-Isopropylcyclohexylcarboxylic acid(有關(guān)物質(zhì)A)、N-(trans-4-Ethylcyclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine(有關(guān)物質(zhì)B)、N-(trans-4-Isopropylclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine-D-phenylalanine(有關(guān)物質(zhì)C)、N-(trans-4-isopropylcyclohexylcarbonyl)-D-phenylalanine-ethyl ester(有關(guān)物質(zhì)D)，本實驗建立了高效液相色譜法測定那格列奈膠囊中有關(guān)物質(zhì)的方法，為控制那格列奈膠囊的質(zhì)量提供了參考。

1儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity LC色譜儀(Agilent technologies);色譜柱為AlltimaTM C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；PHS-3C酸度計(天津市賽得利實驗分析儀器有限公司)；BT25S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，精密度為十萬分之一)；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；那格列奈對照品(購于TLC公司，純度99.9%，批號：tlc1403008)；有關(guān)物質(zhì)A(購于TLC公司，純度99.3%,批號：tlc1407034)；有關(guān)物質(zhì)B(購于TLC公司，純度99.6%,批號：tlc1405028)；有關(guān)物質(zhì)C(購于TLC公司，純度99.2%,批號：tlc1409107)；有關(guān)物質(zhì)D(購于TLC公司，純度99.6%,批號：tlc1404064)；那格列奈膠囊(自制，批號：150109、150203、150402)；參比那格列奈膠囊(海南海靈化學制藥有限公司，規(guī)格為每片30 mg，批號:141207)；乙腈為色譜純；實驗用水為純化水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：AlltimaTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣體積：20 μL；柱溫：30℃。流動相A：0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(含1%磷酸)，用三乙胺調(diào)節(jié)pH=3.0;流動相B：乙腈按照表1進行梯度洗脫。

表1　乙腈洗脫梯度

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液制備取那格列奈膠囊，除去膠囊外殼，將膠囊內(nèi)填充物研細，取適量細粉(約相當于那格列奈25 mg)，精密稱量，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于100 mL容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為那格列奈膠囊供試品溶液。

2.2.2輔料溶液的制備取那格列奈膠囊中的各個輔料，按照制劑處方工藝中的輔料比例進行稱取，充分混合，精密稱量125 mg，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為那格列奈膠囊輔料溶液。

2.2.3有關(guān)物質(zhì)對照品溶液的制備分別精密稱量有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D對照品各10 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度線，搖勻，得到有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的乙腈儲備液。精密量取有關(guān)物質(zhì)各儲備液2.0 mL，分別置于100 mL的容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D對照品溶液，溶液濃度均為2.0 mg·L-1。

2.2.4混合溶液的制備精密量取“2.2.1”項下制備的供試品溶液和“2.2.3”項下制備的各有關(guān)物質(zhì)的對照品溶液，依次置于同一個50 mL容量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為那格列奈和有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的混合溶液。

2.3系統(tǒng)適應性實驗及專屬性實驗 按“2.1”項所述的色譜條件，依次準確量流動相、輔料溶液、混合溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。那格列奈及有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的保留時間如圖1～5中所示，那格列奈峰峰形良好，主峰與各雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5，各峰的理論塔板數(shù)均大于5 000，對稱因子均為1.0左右，對稱性良好；空白溶劑、輔料略有吸收，空白溶劑色譜圖中有微小的溶劑峰、梯度峰，與那格列奈及各有關(guān)物質(zhì)峰均不重合，可扣除，輔料色譜圖中出峰時間很早，可扣除，因而不會影響測定結(jié)果準確性，此方法專屬性較好。

2.4精密度實驗取“2.2.3”項下的有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)操作進樣6次。有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的峰面積值RSD分別為0.75%、0.82%、0.93%、0.64%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.5線性關(guān)系實驗取“2.2.3”項所述的有關(guān)物質(zhì) A 的乙腈儲備液適量置于容量瓶中，加入流動相稀釋配成有關(guān)物質(zhì) A 濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L-1系列溶液，按“2.1”項所述的色譜條件，分別精密量取20 μL依次注入色譜儀，記錄色譜圖。

以有關(guān)物質(zhì)的進樣濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，得到有關(guān)物質(zhì)A回歸方程為A=45.99C- 0.087 2，R= 0.999 58。

依同樣方法得到有關(guān)物質(zhì)B的回歸方程為A=33.55C-0.40，R=0.999 46;

有關(guān)物質(zhì)C的回歸方程為A=38.63C+0.36，R= 0.999 16;

有關(guān)物質(zhì)D的回歸方程為A=45.17C-0.87，R= 0.999 53;

以上結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D在濃度范圍內(nèi)有關(guān)物質(zhì)的濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系，有關(guān)物質(zhì) A、B、C、D濃度的線性均為0.5～10.0 mg·L-1。

2.6定量限與檢測限實驗量取“2.2.3”項下取有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D線性范圍內(nèi)的最低濃度逐漸稀釋，進樣，記錄色譜圖，取信噪比(S/N)為 10 的濃度為定量限濃度，信噪比(S/N)為 3 的濃度為檢測限濃度。測得有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果表2所示。

表2　定量限與檢測限實驗結(jié)果

2.7穩(wěn)定性實驗取“2.2.3”項下的有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的對照品溶液，濾過，精密量取續(xù)濾液各20 μL 分別于0、0.5、1.0、2.0 、4.0 、12 h 時進樣，記錄色譜圖，測得峰面積的RSD值分別為0.9%、1.1%、1.4%、0.8%。結(jié)果表明有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D的溶液在12 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

2.8加樣回收率實驗取那格列奈膠囊，研細，取細粉適量，精密稱定，按“2.2.1”項下的供試品溶液配制方法，配成濃度為150 mg·L-1的溶液，精密量取供試品溶液和有關(guān)物質(zhì)的對照品溶液適量，分別置于10 mL容 量瓶中，再向容量瓶中加入適量的有關(guān)物質(zhì)A，用流動相稀釋至刻度，搖勻，配制成有關(guān)物質(zhì)A的試驗供試品溶液，濾過，精密量取續(xù)濾液20 μL 分別注入色譜儀，記錄色譜圖。相應試驗平行制備3份，并進行相應的檢測。

依同樣方法制備有關(guān)物質(zhì)B、C、D的供試品溶液，并進行檢測。按外標法以峰面積計算回收率，加樣回收率實驗結(jié)果見表3所示。由結(jié)果可知，在此色譜條件下各有關(guān)物質(zhì)的回收率良好。

表3　加樣回收率實驗結(jié)果

2.9那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)的檢測取自制那格列奈膠囊三批和購買的參比制劑，按“2.2.1”項下所述的供試品溶液制備方法，依次配制各批次供試品溶液和參比制劑對照品溶液。按“2.1”項所述的色譜條件，分別精密量取20 μL，依次注入色譜儀，記錄色譜圖，實驗測定結(jié)果如表4所示。實驗結(jié)果表明，自制三批那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)均小于0.1%，均未超過限度要求，與參比制劑有關(guān)物質(zhì)大體上一致或更優(yōu)，符合中國藥典及申報的要求。

表4　那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果/%

3討論

3.1流動相pH值的選擇查閱相關(guān)文獻資料中相似的檢測方法[9-12]，選用流動相pH=1.0進行等度洗脫，結(jié)果顯示理論塔板數(shù)雖較高，但有關(guān)物質(zhì)C、D的色譜峰拖尾嚴重，峰形不好，且有關(guān)物質(zhì)D與主峰的分離度較小，不能較好的分離。本實驗考察了流動相A調(diào)節(jié)為不同的pH值對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)至pH=3.0時，峰形、分離度、塔板數(shù)均符合要求且比其他條件更優(yōu)，故最終選擇此色譜條件。

3.2檢測波長的選擇取那格列奈對照品，按“2.2. 3”項所述方法配制那格列奈對照品溶液，采用TU-1900紫外—可見分光光度計，于200～400 nm進行掃描，結(jié)果如圖6所示，那格列奈在210 nm、258 nm處均有較大吸收；將有關(guān)物質(zhì)A、B、C、D對照品溶液于200～400 nm進行掃描 ，結(jié)果如圖7所示，有關(guān)物質(zhì)的最大吸收均在210 nm處，因此本實驗建立的色譜條件選擇210 nm作為檢測波長。

綜上所述，本實驗所建立的高效液相色譜法測定那格列奈膠囊有關(guān)物質(zhì)的方法，操作簡便，專屬性、適用性較強，分離度很好，適用于那格列奈膠囊中有關(guān)物質(zhì)的控制檢測，同時為那格列奈膠囊質(zhì)量體系的建立提供了參考，為那格列奈仿制藥的申請?zhí)峁┝艘罁?jù)。

參考文獻：

[1] 孫斐.那格列奈治療2型糖尿病的臨床觀察[J].右江民族醫(yī)學院學報,2014(5):716-717.

[2]任國飛.那格列奈新劑型研究進展[J].中國藥業(yè),2014,23(16):127-128.

[3]劉揚,龐嫵燕,趙春燕,等.那格列奈治療2型糖尿病的臨床研究[J].醫(yī)藥論壇雜志,2012,33(1):102-104.

[4]何應妮.格列奈類促胰島素分泌劑治療2型糖尿病的臨床研究[J].醫(yī)學信息,2014,27(9):395-396.

[5]周勇.那格列奈合成工藝改進[J].中國藥房,2009,20(19):1470-1472.

[6]Digiacomo M, Martelli A, Testai L,et al.Synthesis and evaluation of multi-functional NO-donor/insulin-secretagogue derivatives for the treatment of type II diabetes and its cardiovascular complications[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2015,23(3):422-428.

[7]金建忠.那格列奈合成方法研究[J].中國藥學雜志,2007,42(12):946-948.

[8]Nateglinide. USP35[S]:4004-4006.

[9]張寶喜,龔寧波,杜慧,等.那格列奈純度標準物質(zhì)標準值的標定與不確定度評定[J].中國藥師,2014,17(6):915-920.

[10] 劉亮.HPLC法測定血漿中那格列奈的濃度[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2013,9(10):27-28.

[11] 王興軍,許慶棟.HPLC法測定那格列奈膠囊的含量[J].齊魯藥事,2011,30(9):511-512.

[12] Thomas TB,Patil SD,Nanda RK,et al.Stability-indicating HPTLC method for simultaneous determination of nateglinide and metformin hydrochloride in pharmaceutical dosage form[J].Saudi Pharmaceutical Journal,2011,19(4):221-231.

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.017

(收稿日期：2015-04-18，修回日期：2015-06-07)

Determination of the related substances in Nateglinide capsules by HPLC

ZHANG Cui-lan

(Department of Endocrinology, Zhuozhou Hospital,Zhuozhou072750,China)

Abstract:Objective To control the related substances in Nateglinide capsules by HPLC. Methods Seperation was performed on an AlltimaTMC18column (250 mm×4.6 mm，5 μm). The mobile phase was a mixture of ammonium dihydrogen phosphate (pH=3.0) - acetonitrile with flow rate at 1.0 mL·min-1and the column temperature was 30℃. The detection wavelength was 210 nm and injection volume was 20 μL. Results There was a good linearity over the range of 0.5～10.0 mg·L-1with a correlation coefficient greater than 0.999(n=6). Conclusions This method is easy to operate, accurate and highly sensitive , which can be applied to control the related substances in Nateglinide capsules.

Key words:Nateglinide capsules;related substance;HPLC