鄭　芳，朱雪松，李　鵬，李志浩，李春雷，李　聰

(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院藥學部，武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，湖北 十堰　442008)

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◇藥物分析◇

HPLC-DAD法測定“武當三號金銀花”不同部位中蘆丁和木犀草苷的含量

鄭芳，朱雪松，李鵬，李志浩，李春雷，李聰

(湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院藥學部，武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，湖北 十堰442008)

摘要：目的建立HPLC-DAD法測定 “武當三號金銀花” 不同部位中蘆丁和木犀草苷的含量。方法采用Fortis Xi Phenyl柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相為乙腈(A)—0.5%冰醋酸溶液(B)進行線性梯度洗脫；檢測波長為354 nm；柱溫：30℃。結(jié)果蘆丁和木犀草苷在各自測定的范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系(r≥0.999 4)，平均回收率分別為99.4%、99.3%。結(jié)論該法操作簡單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，為控制“武當三號金銀花” 不同部位蘆丁和木犀草苷的質(zhì)量提供了一種可靠的方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；蘆??；木犀草苷；梯度洗脫

“武當三號金銀花”由湖北武當生物醫(yī)藥科技有限公司從山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司引進的亞特紅金銀花，經(jīng)培育適合武當?shù)貐^(qū)生長的優(yōu)質(zhì)金銀花新品種[1]。該花呈紅色，香味濃郁，抗逆性強?！拔洚斎柦疸y花”為忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花，其藤和葉分別為忍冬的干燥莖枝和干燥葉。金銀花、忍冬葉和忍冬藤均具有清熱解毒、疏風通絡(luò)之功效[2-4]。《中國藥典》2010年版一部已將綠原酸和木犀草苷作為金銀花質(zhì)量控制的指標，將綠原酸和馬錢苷作為忍冬藤質(zhì)量控制的指標，但忍冬葉質(zhì)量控制尚未入藥典。忍冬葉為金銀花和忍冬藤的副產(chǎn)物，雖產(chǎn)量較高，但一直被視為非藥用部位而未得到充分利用[5]。金銀花、忍冬葉和忍冬藤除了均含有機酸外，還均含有黃酮類等成分[6-8]。其中，以蘆丁和木犀草苷為代表的黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等多種藥理作用[9-10]。目前，對“武當三號金銀花”中蘆丁和木犀草苷的含量測定未見報道。本研究參考有關(guān)文獻[11-12]，經(jīng)過多次試驗，采用HPLC-DAD法測定“武當三號金銀花”不同部位(花蕾、葉、藤)中蘆丁和木犀草苷的含量，并各自取三批樣品進行了含量測定。

1儀器與試藥

1.1儀器UltiMate 3000 高效液相色譜儀(DIONEX)，配備UltiMate 3000 Photodiode Array Detector、UltiMate 3000 Pump(四元梯度)、LGC-1025M 型柱溫箱、Chromeleon 色譜工作站及手動進樣器；AEU-210型萬分之一電子分析天平(日本島津)；METTLER TOLEDO 十萬分之一電子分析天平；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(功率200～500 W，額定頻率40 kHZ，昆山市超聲儀器有限公司)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率100 W，頻率40 kHZ，昆山市超聲儀器有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機[額定頻率(50±1) Hz，天津市泰斯特儀器有限公司]；GZX-DH-40X 4-5型電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)。

1.2試藥蘆丁對照品(批號：100080-200707，中國藥品生物制品檢定所)；木犀草苷對照品(批號：111720-200604，中國藥品生物制品檢定所)；武當三號金銀花及其葉和藤均于2014年5月18日、5月26日、6月4日采自湖北武當生物醫(yī)藥科技有限公司賽武當金銀花種植基地，經(jīng)湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院陳吉炎教授鑒定為忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花，其藤和葉分別為忍冬的干燥莖枝和干燥葉；乙腈和冰醋酸均為色譜純，均購自天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇和甲醇均為分析純，均購自武漢市中天化工有限責任公司；水為自制注射用水。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備精密稱取蘆丁和木犀草苷對照品各適量，置棕色瓶中，加70%乙醇制成每1 mL中含蘆丁0.104 mg和每1 mL中含木犀草苷0.124 mg的對照品儲備液，均用封口膜封上，置4℃冰箱中備用；各取上述儲備液適量混合得蘆丁和木犀草苷混合對照品溶液(每1 mL中含蘆丁和木犀草苷分別為34.67，41.33 μg)。

2.2供試品溶液的制備

2.2.1“武當三號金銀花”花蕾供試品溶液[2]取“武當三號金銀花”干燥花蕾[鮮品蒸制4 min后，于鼓風電熱恒溫干燥箱(45℃)干燥](過四號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱量，超聲處理[功率250 W，頻率40 kHz，超聲溫度(40±1)℃]30 min，放冷，再稱量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm的有機相過濾頭過濾，取續(xù)濾液適量，作為供試品溶液。

2.2.2“武當三號金銀花”葉供試品溶液取“武當三號金銀花”干燥葉[鮮品直接置于鼓風電熱恒溫干燥箱(45℃)干燥](過四號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，稱量，超聲處理[功率250 W，頻率40 kHz，超聲溫度(40±1)℃]30 min，放冷，再稱量，用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm的有機相過濾頭過濾，取續(xù)濾液適量，作為供試品溶液。

2.2.3“武當三號金銀花”藤供試品溶液取“武當三號金銀花”干燥藤[鮮品直接置于鼓風電熱恒溫干燥箱(45℃)干燥](過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱量，超聲處理[功率250 W，頻率40 kHz，超聲溫度(40±1)℃]30 min，放冷，再稱量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm的有機相過濾頭過濾，取續(xù)濾液適量，作為供試品溶液。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗色譜柱：Fortis Xi 苯基柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動相：以乙腈為A相、0.5 %冰醋酸溶液為B相，進行梯度洗脫(0→14 min，A：14%，流速：0.6 mL·min-1；14→15 min，A：14%，流速：0.6→0.9 mL·min-1；15→35 min，A：14%→35%，流速：0.9→0.4 mL·min-1；35→40 min，A：35%→14%，流速：0.4→0.6 mL·min-1；40→46 min，A：14%，流速：0.6mL·min-1)；蘆丁、木犀草苷檢測波長為：354 nm；柱溫：(30±1) ℃；進樣量：5～20μL。在上述色譜條件下，進樣“2.1”項下混合對照品溶液及“2.2”項下各供試品溶液，得色譜圖如圖1。結(jié)果：蘆丁、木犀草苷保留時間分別約為28.2、32.1 min；理論塔板數(shù)按蘆丁峰計均不低于60 000，按木犀草苷峰計均不低于80 000；各色譜圖中蘆丁和木犀草苷色譜峰的DAD匹配值均不低于999.20，說明各樣品溶液中的蘆丁和木犀草苷色譜峰均與相鄰的色譜峰達到了基線分離。

2.4標準曲線的繪制分別進樣“2.1”項下蘆丁對照品儲備液各0.208、0.416、0.832、1.248、1.664、2.08 μg和木犀草苷的對照品儲備液各0.124、0.248、0.496、0.744、0.992、1.24 μg，記錄各自峰面積。以進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得蘆丁和木犀草苷的回歸方程分別為Y蘆丁=76.96X-0.273 4(r=0.999 4)、Y木犀草苷=103.89X+0.775 3(r=0.999 6)，進樣量的線性范圍分別為0.208～2.08、0.124～1.24 μg。結(jié)果表明，蘆丁和木犀草苷在各自的線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗精密吸取“2.1”項下的蘆丁和木犀草苷混合對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，記錄各自的色譜峰面積，結(jié)果蘆丁和木犀草苷色譜峰面積的RSD分別為0.73%、0.70%(n=6)。

2.6重復(fù)性試驗取批號為20140518的“武當三號金銀花”花蕾、葉、藤干燥粉末各6份，分別按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”項下的方法平行操作，制備供試品溶液，按“2.3”項下的色譜條件分別進樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果“武當三號金銀花”花蕾、葉、藤中蘆丁峰面積的RSD分別為1.96%、1.88%、1.92%(n=6)，木犀草苷峰面積的RSD分別為1.86%、1.90%、1.88%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗取批號為20140518的“武當三號金銀花”花蕾、葉、藤干燥粉末各1份，分別按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”項下的方法平行操作，制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、20、24 h進樣，記錄峰面積，結(jié)果“武當三號金銀花”花蕾、葉、藤中蘆丁峰面積的RSD分別為1.16%、1.28%、1.22%(n=7)，木犀草苷峰面積的RSD分別為1.26%、1.19%、1.23%(n=7)，表明上述各供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗取批號為20140518的“武當三號金銀花”葉干燥粉末(每1 g中含蘆丁和木犀草苷分別為3.46、5.86 mg)12份，每份約0.2 g，精密稱定，均分兩組，一組分別精密加入蘆丁對照品儲備液(104.0 mg·L-1)7.0 mL，另一組精密加入木犀草苷對照品對照品儲備液(124.0 mg·L-1)10.0 mL，按“2.2.2”項下的方法制備樣品，依據(jù)“2.3”項下色譜方法各自進樣10 μL，按外標法計算含量，結(jié)果見表1。

2.9樣品含量測定分別取批號為20140518、20140526和20140604的“武當三號金銀花”干燥花蕾、葉和藤，分別按“2.2.1”、“2.2.2” “2.2.3”項下的方法，制備各自的供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件測定蘆丁和木犀草苷的峰面積，按外標法計算各自含量，結(jié)果見表2。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表2　“武當三號金銀花”不同部位中蘆丁和木犀草苷含量測定結(jié)果(n=3)

3討論

3.1提取條件的確定

3.1.1“武當三號金銀花”花蕾提取條件的確定本試驗參考有關(guān)文獻[1-2]，固定超聲功率(250 W)、超聲頻率(40 kHz)、超聲溫度[(40±1)℃]及液料比(25 mL·g-1)，分別以60%乙醇、70%乙醇和80%乙醇為提取溶劑，對超聲30、45、60 min提取方法進行了初步考察。結(jié)果超聲30 min和超聲45、60 min時蘆丁和木犀草苷的含量相差不大；以60%乙醇和70%乙醇提取蘆丁和木犀草苷時，二者含量均無顯著性差異(以60%乙醇提取時蘆丁的含量比木犀草苷的稍高，當以70%乙醇提取時，則木犀草苷的含量稍高)，但均高于用80%乙醇提取時的含量。故武當三號金銀花提取蘆丁和木犀草苷的條件初步確定為：以70%乙醇為提取溶劑，超聲[功率：250 W、頻率：40 kHz、溫度：(40±1)℃]提取30 min。

3.1.2“武當三號金銀花”葉提取條件的確定本試驗分別對超聲提取[固定超聲頻率為40 kHz和超聲溫度為(40±1)℃，考察功率分別為100、250、500 W和超聲時間分別為30、45、60 min時的提取效果]、提取溶劑(分別為60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和50%甲醇)、和液料比(分別為50、100、150 mL·g-1)幾種單因素試驗進行了初步的考察。結(jié)果在固定超聲頻率(40 kHz)和超聲溫度[(40±1)℃]下，以超聲功率分別為250、500 W和提取時間分別為30、45、60 min時，蘆丁和木犀草苷提取率沒有顯著的差別，從節(jié)省時間、節(jié)約能源和提取后雜質(zhì)相對少等幾方面綜合考慮，將該試驗超聲提取功率和時間分別定為250 W和30 min；在上述超聲條件下，當以60%乙醇為提取溶劑，液料比為150 mL·g-1時，蘆丁和木犀草苷提取率相對較高。故“武當三號金銀花”葉提取蘆丁和木犀草苷的條件初步確定為：以60%乙醇為提取溶劑，液料比為150 mL·g-1，超聲[功率：250 W、頻率：40 kHz、溫度：(40±1)℃]提取30 min。

3.1.3“武當三號金銀花”藤提取條件的確定本試驗參考有關(guān)文獻[1-2]，分別對超聲提取(方法同“3.1.2”項下)、提取溶劑(70%乙醇和50%甲醇)和液料比(25、50 mL·g-1)幾種單因素試驗進行了初步的考察。結(jié)果以70%乙醇為提取溶劑，液料比為50 mL·g-1，超聲提取[超聲頻率、溫度、功率分別定為40 kHz、(40±1)℃、250 W和30 min]時，蘆丁和木犀草苷提取率相對高些。

3.2檢測波長的確定依照“2.3”項的色譜條件，進樣“2.1”項下蘆丁和木犀草苷混合對照品溶液，由Ultimate3000二極管陣列檢測器對蘆丁和木犀草苷色譜峰的在線紫外掃描(波長范圍：190～400 nm)圖譜得知：蘆丁和木犀草苷分別在約354、348 nm波長處有最大吸收，該試驗可以把蘆丁和木犀草苷檢測波長分別定為：354和348 nm。但從圖譜上分析，對于木犀草苷采用蘆丁的最大吸收波長(λ=354 nm)定量，或?qū)τ谔J丁采用木犀草苷的最大吸收波長(λ=348 nm)定量均差別不大。為了簡化該試驗，又考慮到同一供試品進樣時，蘆丁的峰面積比木犀草苷的低，因此該試驗最終將蘆丁和木犀草苷的檢測波長定為354 nm。

3.3色譜柱的選擇《中國藥典》2010年版一部對金銀花中木犀草苷的含量測定采用的色譜柱為苯基柱(Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6 mm×250 mm，5 μm)，本試驗參考相關(guān)文獻[1-2,8]，分別采用苯基柱(Fortis Xi phenyl 4.6 mm×250 mm,5 μm)和C18柱(Fortis 4.6 mm×250 mm，5 μm)同時測定蘆丁和木犀草苷的含量，當采用苯基柱時，二主峰的理論塔板數(shù)均不低于60 000，而采用C18柱時，二主峰的理論塔板數(shù)均低于20 000，并且二主峰與相鄰峰的分離度，前者均大于后者，故本試驗最終采用苯基柱測定“武當三號金銀花”不同部位中蘆丁和木犀草苷的含量。

3.4含量測定的結(jié)果由表2含量測定結(jié)果可知：“武當三號金銀花”的花蕾、葉和藤中蘆丁和木犀草苷的含量高低均為：葉>花蕾>藤,其中葉中木犀草苷的含量幾乎為《中國藥典》2010年版一部規(guī)定的金銀花(含木犀草苷不得少于0.05%)的10倍以上。雖然藤中木犀草苷的含量相對于葉和花蕾而言最低，但其含量卻高于藥典中金銀花中木犀草苷的標準近3倍?！吨袊幍洹?010年版一部規(guī)定：金銀花的質(zhì)控指標為綠原酸和木犀草苷(不得少于0.05%)，無蘆丁作為質(zhì)控標準；規(guī)定忍冬藤的質(zhì)控指標為綠原酸和馬錢苷，無蘆丁和木犀草苷作為質(zhì)控標準；對于忍冬葉，藥典中無任何質(zhì)控指標。忍冬藤和葉是生產(chǎn)金銀花的副產(chǎn)品，一年四季均可采收，資源豐富，若加以合理開發(fā)利用，可以大大緩解市場上金銀花藥材的緊缺?！拔洚斎柦疸y花”不同部位的黃酮類的含量與同一地區(qū)其他品種的金銀花的對應(yīng)部位相比均較高(筆者已經(jīng)對武當?shù)貐^(qū)其他品種的金銀花做過初步的對比研究)，并且，黃酮具有較強抗氧化能力，因此筆者推測其藥性也應(yīng)與其他品種有所不同，入藥時應(yīng)視病情進行定量。

4結(jié)論

本試驗采用反相高效液相色譜法—二極管陣列檢測器對“武當三號金銀花” 不同部位(花蕾、葉、藤)中黃酮類物質(zhì)——蘆丁和木犀草苷的含量進行測定，結(jié)果，該方法操作簡便、重現(xiàn)性好、專屬性強，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，以期為“武當三號金銀花”的花蕾、葉和藤質(zhì)量標準的制定提供參考。

參考文獻：

[1]鄭芳,李鵬,李志浩,等.HPLC-DAD法測定“武當三號金銀花”藤中4種有效成分含量[J].安徽醫(yī)藥,2014,18(11):2062-2065．

[2]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010：179,205．

[3]趙金鳳,周鳳琴,郭慶梅,等.忍冬葉研究進展[J].中國藥房,2010,21(39):3738-3740．

[4]劉偉,鄭振佳,周潔,等.良種金銀花不同采收期發(fā)育程度與品質(zhì)比較研究[J].山東科學,2012,25(5):35-38．

[5]錢正明,李會軍,李萍,等.高效液相色譜法測定忍冬藤和葉中8種活性成分[J].分析化學,2007,35(8):1159-1163．

[6]辛貴忠,錢正明,周建良,等.忍冬藤質(zhì)量標準研究[J].中國藥學雜志,2009,44(1):52-54．

[7]張聰,殷志琦,葉文才,等.忍冬藤的化學成分研究[J].中國中藥雜志,2009,34(23):3051-3053．

[8]張芳,張永清,于曉.RP-HPLC 法同時測定忍冬不同變異類型花蕾中7 種成分[J].中成藥,2012,34(9):1756-1759．

[9]王柯,王艷艷,趙東保,等．HPLC 法測定金銀花不同部位中木犀草素及其苷的含量[J]．河南大學學報(自然科學版),2011,41(1):39-43．

[10] Lee EJ,Kim JS,Kim HP,et al.Phenolic constituents from the flower buds of lonicera japonica and their 5-lipoxygenase inhibitory activities[J]．Food Chemistry,2010,120：134-139．

[11] 梁萱,趙建軍,梁永鋒.金銀花中黃酮提取工藝研究及野生與人工種植金銀花中黃酮含量的比較[J].中南藥學,2013,11(3):173-175．

[12] 郭炬亮,李新霞,支玲．HPLC 測定糙枝金絲桃中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山奈酚[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(11):75-78.

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.015

基金項目：湖北省2011協(xié)同創(chuàng)新中心基金(鄂教科函(2012)56號)

作者簡介：鄭芳，女，主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學，E-mail：zhengfangdf@163.com

通信作者：朱雪松，男，主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學與臨床藥學，E-mail：dfpharmacy@163.com

(收稿日期：2015-02-13,修回日期：2015-07-20)

Determination of the contents of rutin and luteoloside in different parts
of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae” by HPLC-DAD

ZHENG Fang,ZHU Xue-song,LI Peng,et al

(DepartmentofPharmacy,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalUniversity,HubeiKeyLaboratoryof

WudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan,Hubei442008,China)

Abstract:ObjectiveTo determine the contents of rutin and luteoloside in different parts of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae”by HPLC-DAD.MethodsFortis Xi Phenyl column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was used.The mobile phase was acetonitrile(A)-0.5% glacial acetic acid aqueous solution(B)with gradient elution.The detective wavelength was 354 nm.The column temperature was 30℃.ResultsThe rutin and luteoloside showed good linearity(r≥0.999 4)in a detection range and the average recovery rates were 99.4%,99.3%，respectively.ConclusionThe method is simple，sensitive and reproducible，which can be used to control the quality of rutin and luteoloside in different parts of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae”.

Key words：HPLC;rutin;luteoloside;gradient elution