巢　蕾，曹雨誕，陳佩東

(1.江蘇省中醫(yī)院藥劑科,江蘇 南京　210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京　210046)

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黃芩湯抗TNBS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎活性研究

巢蕾1，曹雨誕2，陳佩東2

(1.江蘇省中醫(yī)院藥劑科,江蘇 南京210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京210046)

摘要：目的 研究黃芩湯水煎液中主要成分及對2,4,6-三硝基苯磺酸鈉 (TNBS)造模balb/c小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎的作用。方法HPLC-MS法分析水煎液成分。雄性balb/c 小鼠隨機分為空白對照組，TNBS模型組，柳氮磺嘧啶陽性對照組(500 mg·kg-1)，黃芩湯水煎液1，2，4 g·kg-1治療組。TNBS造模7 d后，研究各組小鼠的結(jié)腸病理評分、微觀評分、體質(zhì)量、小鼠結(jié)腸長度和血清髓過氧化物酶(MPO)。結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品對照，黃芩湯水煎液中含有復(fù)方中主要成分，黃芩湯水煎液可使TNBS造模balb/c小鼠的體質(zhì)量明顯增加，改善身體的一般狀況和小鼠結(jié)腸黏膜的損傷，下調(diào)MPO。結(jié)論黃芩湯水煎液中含有各藥物的主要成分，對TNBS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的治療作用。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎;黃芩湯;髓過氧化物酶;液質(zhì)聯(lián)用;2,4,6-三硝基苯磺酸鈉

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種常見的非透壁性腸道炎癥[1]，盡管目前其確切的發(fā)病機制尚不清楚，但一般認(rèn)為是由于腸道細(xì)菌過度活躍引發(fā)的黏膜免疫反應(yīng)所引起的疾病[2]。黃芩湯由黃芩、炙甘草、白芍和大棗組成，臨床主要治療腹瀉、嘔吐、惡心等腸道疾病，對抗癌藥物引起的腸黏膜損傷具有修復(fù)作用[3]。黃芩湯中各藥物主要含有黃酮類[4-5]、皂苷類[6]、單萜苷類[7]和三萜類[8]等成分，并且具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用[9-12]。近年對黃芩湯的抗?jié)冃越Y(jié)腸作用研究有一定進(jìn)展[13-14]，但對黃芩湯作用的機制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不明確。本實驗對黃芩湯水煎液的化學(xué)成分進(jìn)行了液質(zhì)聯(lián)用分析，并對其抗2,4,6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的活性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

1材料

1.1藥物和試劑黃芩湯由黃芩、白芍、炙甘草和大棗組成，分別購自內(nèi)蒙古(No.121201)、安徽(No.120809)、山東和河北(No.121126)，由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳德康教授鑒定為黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、白芍(PaeonialactifloraPall)、炙甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)和大棗(ZiziphusjujubeMill.)。芍藥苷、黃芩苷、齊墩果酸、烏蘇酸、甘草酸購自中國藥品鑒定所，氧化芍藥苷、羥基芍藥苷、白樺脂酸、甘草次酸、甘草查爾酮A、甘草苷、異麥角甾苷、白楊素購自成都曼思特公司，漢黃芩素、千層紙素A、黃芩素分離自本實驗室。 TNBS購自sigma公司，柳氮磺嘧啶(SASP)，上海三維公司，批號20130514，戊巴比妥鈉，髓過氧化物酶(MPO)試劑盒,南京建成公司,批號20140110。

1.2實驗動物雄性balb/c小鼠(20～24 g)，購自青龍山動物中心，動物許可證號SCIXK(蘇) 2012 -0004。

1.3實驗儀器1290液相色譜系統(tǒng)，6460三重四級桿質(zhì)譜系統(tǒng)(安捷倫)，數(shù)據(jù)采集和處理應(yīng)用MassHunter 工作站軟件 (Version B.03.00)完成 。

2方法

2.1黃芩湯水煎液的制備黃芩300 g，白芍200 g和炙甘草200 g，大棗300 g[3]，以8倍量水煎煮3次， 每次1 h。所得浸膏得率為32.6%，分別配制成1、2、4 g·kg-1給藥劑量。

2.2HPLC-MS分析條件液相色譜條件為Kromasil C18(250 mm×6 mm,5 μm)色譜柱，柱溫 30℃，流動相 A 為0.05%甲酸 ，B為乙腈，梯度洗脫(0～10 min, 85%～80% A; 10～35 min, 80%～75% A;35～55 min, 75%～70% A;55～65 min, 70%～60% A;65～90 min,60%～35%A;90～92.5 min,35%～5% A;92.5～102.5 min,5%A;102.5～110 min,5%～85%A;110～115 min, 85%A)；體積流量0.6 mL·min-1，進(jìn)樣3 μL，檢測波長254 nm。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，負(fù)離子模式掃描；干燥氣溫度350℃，干燥氣流量10 L·min-1，離子源溫度320℃，霧化氣電壓40 psi(1 psi=6.895×103Pa)，毛細(xì)管電壓3 500 V。

2.3動物分組與給藥小鼠飼養(yǎng)溫度22～24℃，隨機分為6組 (n=10)，分別為空白對照組，陽性對照組，TNBS模型組。給藥組為黃芩湯水煎液1、2、4 g·kg-1劑量組。小鼠禁食24 h后，以戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉，通過0.56 mm PE管將三硝基苯磺酸鈉100 mg·kg-1注入小鼠結(jié)腸4 cm處造模。50%TNBS試劑0.1 mL 緩慢注入小鼠結(jié)腸，空白組注入50%乙醇。然后將小鼠垂直倒立，保持2～3 min，放回鼠籠[15]。空白對照組及模型組以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)給藥，陽性對照組以柳氮磺嘧啶(500 mg·kg-1)給藥，給藥組為黃芩湯水煎液1、2、4 g·kg-1，持續(xù)7 d。

2.4樣品采集造模7 d后，小鼠眼眶取血，然后處死。將小鼠腹膜剪開，取距肛門2 cm以上3～5 cm處結(jié)腸，以PBS液反復(fù)清洗，置于濾紙上吸干水分。取相同位置結(jié)腸，在10%福爾馬林中固定24 h，用于病理切片。所取血液放置5 min后，3 000 r·min-1離心,取出血清后置于PE管，-80℃保存。

2.5結(jié)腸病理和組織學(xué)評價根據(jù)TNBS誘導(dǎo)的炎癥損傷進(jìn)行結(jié)腸病理評價：0級，沒有損傷;1級，水腫，沒有潰瘍；2級，輕微潰瘍，沒有明顯炎癥；3級，潰瘍伴有1處炎癥；4級，2處或以上炎癥伴有潰瘍面積小于1 cm；5級，2處以上嚴(yán)重潰瘍或大于1 cm炎癥區(qū)域。結(jié)腸組織以4%多聚甲醛固定，脫水，隨后嵌入石蠟，進(jìn)行HE染色組織學(xué)評價：0級，正常結(jié)腸;1級，黏膜炎癥；2級，炎癥病灶于黏膜表層或下層；3級，病灶于肌層；4級，病灶位于絨毛膜；5級，嚴(yán)重潰瘍和炎癥[15]。

2.6髓過氧物酶評價小鼠血清MPO活力以spectrophotometer (Bio-Bad, USA)測定，波長460 nm ，按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行測定[16-17]。

3結(jié)果

3.1黃芩湯水煎液HPLC-MS分析黃芩湯水煎液總離子流圖見圖1，其中A為混和對照品，B為黃芩湯水煎液。從分析結(jié)果可以看出，黃芩湯樣品中含有包括黃芩中的黃芩苷等主要黃酮類成分，白芍中的芍藥苷等單萜苷類成分，炙甘草中的甘草酸等三萜及黃酮類成分及大棗中的白樺脂酸等三萜類成分。

A混合對照品B黃芩水煎液樣品

圖1黃芩湯水煎液總離子流圖

注：1.氧化芍藥苷；2.羥基芍藥苷；3.芍藥苷；4.異麥角甾苷；5.甘草苷；6.麥角甾苷；7.黃芩苷；8.甘草素；9.黃芩素；10.甘草酸；11.千層紙素A；12.白楊素；13.漢黃芩素；14.甘草查爾酮A；15.甘草次酸；16.烏蘇酸；17.白樺脂酸；18.齊墩果酸。

表1　黃芩湯對TNBS造模小鼠結(jié)腸病理評分、體質(zhì)量、結(jié)腸和MPO的影響

注：與對照組比較*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較#P<0.05，▲P<0.01。

3.2病理學(xué)觀察及損傷評分造模后，各組的體質(zhì)量變化、結(jié)腸長度、宏觀損傷評分和MPO結(jié)果見表1。

小鼠經(jīng)TNBS造模后出現(xiàn)皮毛疏散、進(jìn)食減少、懶動、腹瀉和便血等癥狀。小鼠體質(zhì)量下降明顯，結(jié)腸部位表現(xiàn)出不同程度的紅腫和潰瘍。具體數(shù)據(jù)見表1。由此可以看出，模型組小鼠的結(jié)腸長度為(5.98±0.30)cm，而體質(zhì)量下降(-19.23 ±2.15)%，與對照組比較明顯下降。結(jié)腸病理評分和血清MPO活力則顯著上升，與對照組比較均有顯著性差異，表明造模成功。經(jīng)過柳氮磺嘧啶和黃芩湯治療后，結(jié)腸長度和體質(zhì)量增長明顯，而結(jié)腸病理評分和MPO活力則顯著下降，與模型組相比較均有顯著性差異，表明對潰瘍性結(jié)腸炎有治療作用，且黃芩湯三個劑量組呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

3.3組織學(xué)評價對造模小鼠結(jié)腸組織的HE染色組織學(xué)評價發(fā)現(xiàn)，陽性對照組有黏膜的輕微浸潤，空白組有正常上皮的黏膜，模型組顯示了黏膜有炎性浸潤并且伴有嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)扭曲，竇炎和隱窩膿腫，藥物治療組表明局部灶腺腔有凋亡細(xì)胞，但比模型組有較大改善,見圖2。

4討論

黃芩湯中主要成分具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用。應(yīng)用三硝基苯磺酸鈉法制備的UC大鼠模型是探討UC發(fā)病的免疫學(xué)機制和研究開發(fā)UC新藥的一個理想模型，本實驗選擇TNBS模型造模。

通過HPLC-MS可以看出，黃芩湯水煎液中保留了各藥物中主要活性成分，其中黃芩中的黃芩苷、白芍中的芍藥苷、甘草中的甘草酸和大棗中的三萜苷元白樺脂酸等都存在于水煎液中。這些成分都具有調(diào)節(jié)免疫和抗菌、抗炎的作用,其中的黃芩苷、甘草酸等也是黃芩湯血清中的主要成分[18]。

造模后小鼠的結(jié)腸明顯縮短，體質(zhì)量下降明顯，有便血、懶動等癥狀，而MPO活力顯著增加是體內(nèi)炎癥的重要表現(xiàn)[19]。陽性對照組和各給藥組與模型組相比，結(jié)腸長度顯著增加，體質(zhì)量恢復(fù)明顯，MPO活力下降，結(jié)腸損傷恢復(fù)。本實驗結(jié)果表明，黃芩湯水煎液對潰瘍性結(jié)腸炎具有較好的治療作用，且呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

目前，全球治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物有100余種，而正在研究的藥物多達(dá)近80種，包括水楊酸類藥物如美沙拉嗪，腫瘤壞死因子拮抗劑如戈利木單抗，免疫抑制劑如芬戈莫德、山喜多 ，干細(xì)胞療法藥物如remestemcel-I，但這些藥物停藥后容易復(fù)發(fā)，長期應(yīng)用副作用大。黃芩湯出自《傷寒論》，是“醫(yī)圣”張仲景傳世的“經(jīng)方”之一，本實驗研究了黃芩湯水煎液所含成分及其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎作用，為進(jìn)一步研究其作用機制提供了依據(jù)。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.012

基金項目：南京中醫(yī)藥大學(xué)風(fēng)險基金(No CX201202)

通信作者：陳佩東，男，博士，副教授，研究方向：中藥化學(xué)及活性成分研究, E-mail:chenpeidong1970 @163.com

(收稿日期:2015-08-20,修回日期:2015-09-04)

Effect of huangqin decoction on TNBS induced ulcerative colitis in mice

CHAO Lei1,CAO Yu-dan2, CHEN Pei-dong2

(1.JiangsuHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;

2.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the main constituents and the effects of Huangqin decoction on 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) induced colitis in mice. Methods The decoction was analyzed by HPLC-MS, and the animals were randomly divided into 6 groups(n=10):normal control, TNBS control, positive control(500 mg·kg-1) and Huangqin decoction groups with 1,2,4 g·kg-1respectively. 7 days after the induction of colitis with TNBS, the effects were studied by pathological score, histological analysis, body loss, colon length as well as by determination of MPO.Results The decoction had the main compounds of the plants. After the treatment with the decoction, the body weight and colon length were increased, the microscopic and macroscopic score were lowered, and the level of serum MPO activity was markedly decreased. Conclusion Hangqin decoction has the main constituents from various plants, and is effective in the treatment of colitis induced by TNBS.

Key words：ulcerative colitis；huangqin decoction;MPO;HPLC/MS;2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid