崔永亮 蔣軍廣 譚偉麗 安金路 宋衛(wèi)衛(wèi) 郭世放

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

凋亡相關(guān)基因caspase-8在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

崔永亮 蔣軍廣 譚偉麗 安金路 宋衛(wèi)衛(wèi) 郭世放

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

目的 探討半胱天冬酶(caspase)-8在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及臨床意義。方法 免疫組織化學(xué)法(S-P法)檢測(cè)caspase-8在NSCLC(50例)及正常肺組織(20例)中的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高(χ2=5.773，P=0.016)。TNMⅢ期和Ⅳ期者陽(yáng)性率要高于Ⅰ期和Ⅱ期(χ2=6.417，P=0.011)。caspase-8與細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r=0.885，P=0.000)。結(jié)論 caspase-8與NSCLC的發(fā)展關(guān)系密切，caspase-8陽(yáng)性表達(dá)可能預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

caspase-8;肺腫瘤;細(xì)胞凋亡;免疫組織化學(xué)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80% ～85%，其中60%～80%的肺癌患者在診斷時(shí)已屬晚期，治療多采用以化療為主的綜合治療〔1〕。腫瘤的發(fā)生與基因密切相關(guān)，腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵是基因突變或表達(dá)異常。細(xì)胞凋亡在肺癌中的作用已有較多研究，但是凋亡基因caspase-8在NSCLC中的表達(dá)及在細(xì)胞凋亡中的作用研究尚少。本文旨在探討caspase-8在NSCLC中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 隨機(jī)選取我院病理科2010～2012年經(jīng)胸外科切除的NSCLC標(biāo)本50例，年齡44～77歲，手術(shù)前均未接受放化療及其他治療且病理診斷明確。按照美國(guó)聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期〔2〕。其中男33例，女17例;年齡≥60者28例，年齡＜60歲22例;鱗癌27例，腺癌23例;高分化9例，中分化26例，低分化15例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例;TNM分期Ⅰ期加Ⅱ期共31例，Ⅲ期加Ⅳ期共19例;吸煙23例，不吸煙27例;腫瘤直徑＞3 cm者32例，≤3 cm者18例;腫瘤位于左側(cè)20例，右側(cè)30例;有胸腔積液者9例，無(wú)胸腔積液者41例。另選取20例距

所有病理標(biāo)本均被蠟塊包埋，由病理科專業(yè)人員切片，切完后隨即放入60℃恒溫烤箱內(nèi)烘烤4 h，以防實(shí)驗(yàn)過(guò)程中反復(fù)沖洗標(biāo)本導(dǎo)致切片脫離載玻片。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 Rabbit Anti-caspase-8、羅氏TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒、免疫組化染色試劑盒來(lái)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;濃縮型DAB試劑盒來(lái)自北京中杉生物工程公司。

1.2.2 S-P法染色 50例NSCLC組織及20例正常肺組織切片放入60℃恒溫烤箱里30 min;梯度酒精脫蠟、水化;磷酸鹽緩沖液(PBS)抗原修復(fù);3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性;非免疫性動(dòng)物血清阻斷非特異性反應(yīng);滴加一抗，放入4℃冰箱過(guò)夜;第2天滴加生物素化標(biāo)記的二抗;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素;DAB顯色;蘇木素復(fù)染;梯度酒精脫水;中性樹(shù)膠封片。

1.2.3 TUNEL法 烤片、脫蠟、脫水;Proteinase K工作液處理癌組織切片;TUNEL反應(yīng)混合液處理肺癌組織;滴加converter-POD;DAB顯色;蘇木素復(fù)染;梯度酒精脫水;中性樹(shù)膠封片。

1.2.4 陽(yáng)性結(jié)果判斷 免疫組化結(jié)果判定:caspase-8在NSCLC細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。從兩方面進(jìn)行判斷，①陽(yáng)性染色程度:無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②染色細(xì)胞百分率，高倍鏡(400倍)下每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，每張切片隨機(jī)挑選10個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總癌細(xì)胞數(shù)百分比，＜10%為0分，10% ～25%為1分，26% ～50%為2分，≥51%為3分。兩個(gè)定量數(shù)字相加，總分值＜4為陰性，≥4為陽(yáng)性。細(xì)胞凋亡陽(yáng)性結(jié)果判定:利用TUNEL法，腫瘤細(xì)胞核被染為棕黃色，用光學(xué)顯微鏡，計(jì)數(shù)每1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。需排除嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和壞死灶，

避免造成假陽(yáng)性結(jié)果〔3〕。凋亡細(xì)胞指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、直線相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 caspase-8在NSCLC組織中的表達(dá) 細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)免疫組織化學(xué)法染成棕黃色，肺癌組織陽(yáng)性率為62.0%(31/50)，正常肺組織陽(yáng)性率為65%(13/20)，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.055，P=0.814)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性率高，差異顯著(χ2=5.773，P=0.016)。TNM Ⅲ期和Ⅳ期陽(yáng)性率高于Ⅰ期和Ⅱ期(χ2=6.417，P=0.011)。caspase-8的表達(dá)與性別、年齡、病理分型、高中低分化、吸煙、腫瘤大小、腫瘤位置、胸腔積液無(wú)明顯關(guān)系(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 caspase-8的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征關(guān)系〔n(%)〕

2.2 caspase-8與細(xì)胞凋亡 利用直線相關(guān)分析表明，caspase-8與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(r=0.885，P=0.000)。其中0分AI值3.60±0.58 ，1～2分為5.83±0.34，3～4分為7.64±1.46，5～6分為10.98±1.67。

3 討論

近年來(lái)，caspase家族的異常與腫瘤的發(fā)生成為研究的熱點(diǎn)，Poulaki等〔4〕研究表明，caspase-8表達(dá)缺失或低表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡刺激敏感性降低，可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，NSCLC患者修復(fù)此基因可能對(duì)治療有益。

宗振峰等〔5〕發(fā)現(xiàn)肺癌組織中為64.7%，正常肺組織中caspase-8的陽(yáng)性率為73.5%，無(wú)明顯差異，但對(duì)于癌組織中的caspase-8蛋白的表達(dá)強(qiáng)度和定位要明顯的高于正常組織的表達(dá)。潘崢等〔6〕利用免疫組織化學(xué)探討 caspase-8在人乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性，caspase-8表達(dá)的陽(yáng)性率顯著低于相應(yīng)的癌旁組織。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與宗振峰等〔5〕報(bào)道結(jié)果一致。杜寧等〔7〕利用免疫組織化學(xué)、RNA干擾技術(shù)來(lái)探索 caspase-8在NSCLC A549細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)caspase-8在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中有高表達(dá)，沒(méi)有表達(dá)caspase-8的NSCLC A549細(xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移能力較低。宗振峰等〔5〕研究表明NSCLC組織中caspase-8蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果提示caspase-8在NSCLC淋巴轉(zhuǎn)移過(guò)程中有重有作用，caspase-8的表達(dá)下調(diào)與缺失與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。宗振峰〔5〕、杜寧等〔7〕表明，NSCLC 中caspase-8蛋白表達(dá)與TNM分期有關(guān)。與本實(shí)驗(yàn)TNM分期結(jié)果一致，提示caspase-8的下調(diào)預(yù)示患者預(yù)后差。潘崢等〔6〕發(fā)現(xiàn)caspase-8表達(dá)與高中低分化、腫瘤大小密切相關(guān)。沈俊俊等〔8〕利用 RT-PCR 和免疫組化方法檢測(cè) NF-κB、caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)，胃癌組織中的caspase-8蛋白表達(dá)僅與腫瘤分化程度有關(guān)，NF-κB蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。NF-κB通路活化可能通過(guò)下調(diào)caspase-8表達(dá)發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。而本實(shí)驗(yàn)中高、中、低分化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。產(chǎn)生分歧的原因可能與樣本量、試驗(yàn)方法等不一致有關(guān)。另外基因下調(diào)或缺失導(dǎo)致凋亡減少，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

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R734.2

A

1005-9202(2015)09-2431-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.055

河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目(102102310133)

蔣軍廣(1963-)，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授，主要從事呼吸疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

崔永亮(1988-)，男，在讀碩士，主要從事呼吸疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。NSCLC組織旁3 cm以上正常組織(病理證實(shí))為對(duì)照組。

〔2013-07-11修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)